TCVN 8677-1:2011 ISO/TS 17764-1:2002 Xác định hàm lượng axit béo-Phần 1: Phương pháp chuẩn bị metyl este

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8677-1:2011

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO –

PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ METYL ESTE

Animal feeding stuffs – Determination of the content of fatty acids –

Part 1: Preparation of methy esters

Lời nói đầu

TCVN 8677-1:2011 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 17764-1:2002;

TCVN 8677-1:2011 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị. Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO –

PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ METYL ESTE

Animal feeding stuffs – Determination of the content of fatty acids –

Part 1: Preparation of methy esters

1. Phạm vi áp dụng

Bộ ISO/TS 17764 qui định các phương pháp định lượng các axit béo riêng rẽ và tổng hàm lượng axit béo (axit béo có thể rửa giải).

Tiêu chuẩn này qui định hai phương pháp chuẩn bị metyl este của các axit béo từ dầu mỡ động thực vật và các hỗn hợp axit béo từ các nguyên liệu thô dùng trong thức ăn chăn nuôi hỗn hợp, các axit béo có nguồn gốc từ các chất chiết chất béo của thức ăn chăn nuôi, bao gồm các chất béo và các hỗn hợp axit béo chứa axit butyric.

Phương pháp bo trifluoride (BF₃) là phương pháp chung liên quan đến việc chuẩn bị metyl este của các axit béo có từ sáu nguyên tử C trở lên, có nguồn gốc từ chất béo, dầu và axit béo tự do.

Phương pháp KOH/HCl liên quan đến việc chuẩn bị metyl este của axit béo có từ bốn nguyên tử C trở lên. Phương pháp này cũng có thể được dùng để định lượng các axit béo có chiều dài chuỗi ngắn hơn mười nguyên tử C trong các hỗn hợp axit béo tự do.

Các metyl este tạo thành có thể được sử dụng để phân tích sắc ký khí-lỏng (GLC).

CHÚ THÍCH 1: Các chất không xà phòng hóa không loại bỏ được, nếu có mặt với một lượng đáng kể, thì sẽ gây nhiễu phép phân tích sắc khí.

CHÚ THÍCH 2: Tiêu chuẩn ISO/TS 17764-2 mô tả việc áp dụng sắc ký khí với cột mao quản và detector ion hóa ngọn lửa để xác định hàm lượng axit béo trong một loại chất béo bằng cách sử dụng các metyl este của axit béo thu được theo phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4331:2001 (ISO 6492:1999), Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng chất béo.

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 6128:1996 (ISO 661:1989), Dầu mỡ động vật và thực vật – Chuẩn bị mẫu thử.

3. Chiết chất béo

3.1. Yêu cầu chung

Chiết chất béo để xác định hàm lượng axit béo có thể xà phòng hóa có trong thức ăn chăn nuôi hoặc thức ăn hỗn hợp phù hợp với phân loại thức ăn chăn nuôi như mô tả trong TCVN 4331:2001 (ISO 6492:1999) với những sửa đổi sau đây:

3.2. Mẫu loại A

Tiến hành chiết chất béo theo 9.5.1 của TCVN 4331 (ISO 6492).

Làm bay hơi dung môi bằng thiết bị cô quay trên nồi cách thủy ở nhiệt độ không quá 40^oC. Sau đó làm khô phần cặn 2h trong tủ sấy chân không ở 40 ^oC ± 2 ^oC.

3.3. Mẫu loại B

Chiết chất béo theo hai bước. Bước thứ nhất, tiến hành theo 9.5.1 của TCVN 4331 (ISO 6492), xử lý phần mẫu thử theo 9.3 của TCVN 4331 (ISO 6492) như mẫu loại A.

Thu lấy phần chiết chất béo vào bình khô. Để cho dung môi bay hết khỏi phần cặn bằng cách để ống chiết phơi ra ngoài không khí.

Tiến hành thủy phân phần cặn theo 9.4 của TCVN 4331 (ISO 6492).

Sau khi thủy phân, làm khô phần cặn trong ống chiết 60 min trong tủ sấy chân không ở 40 ^oC ± 2 ^oC.

Chiết phần cặn theo 9.5.1 của TCVN 4331 (ISO 6492).

Cho dịch chiết chất béo vào phần dịch chiết thứ nhất.

Làm bay hơi dung môi bằng bộ cô quay trên nồi cách thủy ở nhiệt độ không quá 40 ^oC và làm khô phần cặn 2 h trong tủ sấy chân không ở 40 ^oC ± 2 ^oC.

4. Chuẩn bị mẫu thử của chất béo hoặc của dịch chiết chất béo

Nếu mẫu chất béo hoặc dịch chiết chất béo không tan chảy hoàn toàn thì làm nóng mẫu đến nhiệt độ cao hơn so với nhiệt độ nóng chảy không quá 10 ^oC. Xem TCVN 6128 (ISO 661).

5. Phương pháp chuẩn bị các metyl este của axit béo có trên sáu nguyên tử C (phương pháp BF₃)

5.1. Nguyên tắc

Dùng natri hydroxit metanolic để xà phòng hóa glyxerit. Xà phòng được chuyển thành các metyl este bằng phản ứng với phức chất bo triluoride/metanol.

5.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử và dung môi loại tinh khiết phân tích.

5.2.1. Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2.2. Axit heptadecanoic (chất chuẩn nội), có độ tinh khiết ít nhất 99 %.

5.2.3. Natri hydroxit, dung dịch trong metanol, c(NaOH) ≈ 0,5 mol/l.

Hòa tan 2 g natri hydroxit trong 100 ml metanol chứa không quá 0,5 % (phần khối lượng) nước. Nếu dung dịch đã được bảo quản trong một thời gian khá dài thì một lượng nhỏ natri carbonat có thể tạo thành kết tủa màu trắng, điều này không làm ảnh hưởng đến việc chuẩn bị metyl este.

Có thể sử dụng kali hydroxit trong metanol có cùng nồng độ thay cho natri hydroxit.

5.2.4. Bo trifluoride (BF₃), dung dịch trong metanol, từ 10 % đến 15 % (phần khối lượng).

CẢNH BÁO – Bo trifluoride là một chất độc. Do đó, khuyến cáo người phân tích không pha chế dung dịch bo trifluoride trong metanol từ metanol và bo trifluoride.

Các dung dịch này có bán sẵn trên thị trường.

Trong phép phân tích sắc ký khí đối với metyl este, một số thuốc thử nhất định có thể làm tăng các pic gây nhiễu cho phép phân tích. Cụ thể, các dung dịch BF₃ có thể gây ra các pic trong vùng metyl este của axit béo có 20 nguyên tử C hoặc 22 nguyên tử C. Nên kiểm tra thuốc thử bằng cách chuẩn bị metyl este của axit oleic sau đó phân tích sắc ký khí. Các thuốc thử phải không làm tăng các pic gây nhiễu khi phân tích sắc ký khí các metyl este của axit béo.

5.2.5. n-hexan hoặc n-heptan.

5.2.6. Natri clorua, dung dịch nước bão hòa.

5.2.7. Natri sulfat, khan.

5.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.3.1. Bình cầu đáy tròn, dung tích 50 ml, có cổ mài và nút thủy tinh mài.

5.3.2. Chất trợ sôi, không chứa chất béo.

5.3.3. Bình ngưng hồi lưu, chiều dài hiệu quả từ 20 cm đến 30 cm, có khớp nối mài để gắn với bình cầu.

5.3.4. Pipet chia độ, dung tích nhỏ nhất là 10 ml và được gắn với bầu cao su hoặc pipet tự động.

5.3.5. Lọ nhỏ, có nắp vặn.

5.4. Cách tiến hành

5.4.1. Yêu cầu chung

Do tính độc của bo trifluoride nên việc metyl hóa tốt nhất được tiến hành trong tủ hút khói được thông thí. Cần rửa tất cả các dụng cụ thủy tinh bằng nước ngay sau khi sử dụng.

Nếu các axit béo chứa trên hai liên kết đôi thì cần loại không khí ra khỏi bình bằng cách bơm khí nitơ có hàm lượng oxi nhỏ hơn 5 mg/kg qua dung dịch trong vài phút và duy trì dòng khí nitơ ở phần trên của bình ngưng trong suốt quá trình xà phòng hóa tiếp theo.

Khi chuẩn bị các metyl este của axit béo để phân tích sắc ký khí-lỏng, thì không loại dung môi ra khỏi dung dịch metyl este.

5.4.2. Phần mẫu thử

Cân từ 100 mg đến 250 mg mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 4), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình cầu đáy tròn (5.3.1). Cho axit heptadecanoic (5.2.2) có khối lượng khoảng 20 % phần khối lượng làm chất chuẩn nội vào bình cầu và cân chính xác đến 0,1 mg. Cân một lượng tương tự của mẫu thử đã được chuẩn bị cho vào bình cầu đáy tròn thứ hai.

Xử lý cả hai bình theo cùng một cách như sau:

Nếu phần mẫu thử có dầu hoặc chất béo thì tiến hành theo 5.4.3.

Nếu phần mẫu thử hoàn toàn gồm các axit béo tự do hoặc xà phòng thì tiến hành theo 5.4.5.

Nếu lượng mẫu không đủ thì có thể dùng phần mẫu thử nhỏ hơn 100 mg. Thuốc thử và dung môi qui định phải được giảm theo tỷ lệ và thể tích của các thiết bị điều chỉnh.

5.4.3. Xà phòng hóa

Cho 4 ml natri hydroxit, dung dịch metanolic (5.2.3) và chất trợ sôi (5.3.2). Gắn bình ngưng (5.3.3) vào bình cầu.

Đun sôi hồi lưu cho đến khi hết các giọt chất béo và đun tiếp 30 min.

Nếu còn lại bất kỳ chất nào chưa xà phòng hóa thì có thể gây nhiễu phép phân tích, do đó, dung dịch sau khi xà phòng hóa có thể cần pha loãng bằng nước rồi được chiết bằng dietyl ete, hexan hoặc ete dầu mỏ. Loại bỏ dịch chiết. Sau khi axit hóa dung dịch xà phòng còn lại, các axit béo có thể được tách ra và được metyl hóa theo 5.4.5.

5.4.4. Chuyển về metyl este trong trường hợp mẫu là chất béo hoặc dầu

Dùng pipet chia độ (5.3.4), cho 5 ml dung dịch bo trifluoride/metanol (5.2.4) vào dung dịch đang sôi qua đầu của bình ngưng. Tiếp tục đun sôi trong 3 min.

Tiến hành theo 5.4.6.

5.4.5. Chuyển về metyl este nếu mẫu chỉ chứa axit béo tự do hoặc xà phòng

Dùng pipet chia độ (5.3.4) cho 5 ml dung dịch bo trifluoride/metanol (5.2.4) vào bình cầu. Gắn bình ngưng (5.3.3) vào bình cầu. Đun sôi trong 3 min.

5.4.6. Chiết

Lấy bình ra khỏi nguồn nhiệt. Thêm 1 ml đến 3ml n-hexan (5.2.5) qua đầu của bình ngưng.

CHÚ THÍCH: Không giới hạn thể tích của dung môi được thêm vào.

Để nguội đến nhiệt độ phòng. Lấy bình ngưng và thêm khoảng 15 ml natri clorua bão hòa (5.2.6).

Đậy bình và lắc mạnh. Thêm tiếp dung dịch natri clorua bão hòa (5.2.6) lên đến cổ bình. Để yên cho hai pha tách ra. Dùng pipet chuyển toàn bộ lớp phía trên vào lọ nhỏ (5.3.5). Chiết dung dịch muối thêm ba lần với 1ml đến 3 ml n-hexan (5.2.5) bằng cách lắc vài lần và chuyển lớp phía trên vào lọ.

Cho thêm một lượng nhỏ natri sulfat khan (5.2.7) để loại bỏ hết nước khỏi dung dịch.

Nếu khối lượng của phần mẫu thử trong khoảng từ 100 mg đến 250 mg thì nồng độ của metyl este trong dung dịch là khoảng 3 % (phần khối lượng). Dung dịch này được dùng để phân tích sắc ký khí.

Nếu dùng để bơm lên cột lạnh trong phép phân tích sắc ký khí thì chuẩn bị dung dịch pha loãng bằng cách dùng pipet cho 0,25 m; dung dịch vào bình định mức 25 ml và thêm n-hexan (5.2.5) đến vạch.

6. Phương pháp chuẩn bị metyl este của các axit béo có trên 4 nguyên tử C (phương pháp KOH-HCl)

6.1. Nguyên tắc

Các glyxerit được chuyển về metyl este bằng phản ứng chuyển hóa este với kali metanolat trong metanol nguyên chất. Các axit béo tự do được este hóa bằng dung dịch axit clohydric trong metanol.

6.2. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử và dung môi loại tinh khiết phân tích.

6.2.1. Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).

6.2.2. Axit heptadecanoic (chất chuẩn nội), có độ tinh khiết khoảng 99 %.

6.2.3. n-hexan hoặc n-heptan.

6.2.4. n-pentan.

6.2.5. Kali metanolat, dung dịch trong metanol, c(CH₃OK) 2 mol/l.

Hòa tan 7,8 g kali kim loại trong 100 ml metanol nguyên chất. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

Có thể sử dụng dung dịch natri metanolat trong metanol có cùng nồng độ để thay cho dung dịch kali metanolat.

6.2.6. Natri sulfat, khan.

6.2.7. Metanol, khan.

Cho 5 g natri sulfat (6.2.6) vào bình cầu có chứa 250 ml metanol. Đậy bình rồi lắc mạnh. Lọc dung dịch qua giấy lọc vào bình nón (6.3.1) và đậy kín bình này.

6.2.8. Axit clohydric, dung dịch trong metanol, w(HCl)  20 % (phần khối lượng).

Cân 80 g metanol (6.2.7), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón (6.3.1).

Hứng cho khí axit clohydric đi qua dung môi được khuấy để làm nguội cho đến khi khối lượng của dung dịch tăng khoảng 20 g. Tiếp tục để dung dịch nguội.

Dung dịch này có thể giữ được 3 tháng nếu được để trong bình đậy kín và bảo quản nơi tối.

6.3. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.3.1. Bình nón, dung tích 250 ml, có cổ mài và được đậy bằng nắp thủy tinh mài.

6.3.2. Lọ phản ứng, dung tích khoảng 10 ml, được đậy bằng màng kín và nắp vặn.

6.3.3. Ống đong chia độ, có dung tích 10 ml.

6.3.4. Thiết bị đốt nóng bằng điện, có thể duy trì nhiệt độ ở (85 ± 3) ^oC, có gắn với que khuấy từ.

6.4. Cách tiến hành

Cân từ 50 mg đến 75 mg mẫu thử đã được chuẩn bị (Điều 4), chính xác đến 0,1 mg, cho vào hai lọ phản ứng (6.3.2). Thêm vào một bình, một lượng axit heptadecanoic (6.2.2) khoảng 20 % khối lượng của phần mẫu thử và cân chính xác đến 0,1 mg làm chất chuẩn nội.

Xử lý cả hai lọ theo cùng một cách như sau:

Thêm 4 ml n-hexan (6.2.3). Sử dụng 4 ml n-pentan thay cho n-hexan thì dùng phương pháp bơm lên cột lạnh để phân tích bằng sắc ký khí các axit béo có ít hơn 10 nguyên tử C.

Thêm khoảng 75 mg natri sulfat khan (6.2.6) và lắc để hòa tan phần mẫu thử.

Thêm 0,20 ml kali metanolat (6.2.5), đậy lọ phản ứng và lắc mạnh trong khoảng từ 20 s đến 50 s. Dung dịch bị đục ngay do tạo thành glyxerol lắng xuống nhanh. Thêm 2 ml dung dịch axit clohydric (6.2.8) và khuấy bằng que khuấy từ. Đậy lọ phản ứng và đặt vào bộ phận đốt nóng bằng điện (6.3.4), đã làm nóng trước đến nhiệt độ 85 ^oC. Đun trong 20 min trong khi vẫn khuấy đều. Lắc hỗn hợp vài lần trong giai đoạn này.

Làm nguội lọ cùng với lượng chứa bên trong đến nhiệt độ phòng dưới dòng nước lạnh và lắc mạnh.

Gạn lớp phía trên có metyl este. Không loại dung môi ra khỏi dung dịch metyl este.

Nếu khối lượng của phần mẫu thử trong khoảng từ 50 mg đến 75 mg thì nồng độ của metyl este trong dung dịch ở khoảng 2 % (phần khối lượng). Dung dịch này dùng để phân tích sắc ký khí.

Nếu dùng để bơm lên cột lạnh trong phép phân tích sắc ký khí, thì chuẩn bị dung dịch pha loãng bằng cách dùng pipet cho 0,25 ml dung dịch này vào định mức 25 ml và thêm n-hexan (6.2.4) cho đến vạch.

7. Bảo quản

Các dung dịch metyl este thu được thích hợp để phân tích sắc ký khí ngày. Dung dịch metyl este có thể được bảo quản vài tuần trong điều kiện khí trơ ở nhiệt độ từ 4 ^oC đến 8 ^oC, nếu cần.

Khi cần phải bảo quản lâu hơn, để tránh việc oxi hóa metyl este, nên bổ sung dung dịch chất chống oxit hóa ở nồng độ mà không ảnh hưởng đến phép phân tích sắc ký khí. Ví dụ: bổ sung 0,05 g BHT (butyl hydroxy toluen) trên một lít.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp este hóa đã dùng (ví dụ: phương pháp BF₃ hoặc phương pháp KOH/HCl), viện dẫn trong tiêu chuẩn này.

- mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử.