TCVN 6831-1:2010 ISO 11348-1:2007 Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang)-Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 6831-1:2010

ISO 11348-1:2007

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN MỚI NUÔI CẤY

Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using freshly prepared bacteria

Lời nói đầu

TCVN 6831-1:2010 thay thế TCVN 6831-1:2001 (ISO 11348-1:1998).

TCVN 6831-1:2010 hoàn toàn tương đương ISO 11348-1:2007.

TCVN 6831-1:2010 do Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 146 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 6831 Chất lượng nước - Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) gồm các tiêu chuẩn sau:

- TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1:2007), Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy;

- TCVN 6831-2:2010 (ISO 11348-2:2007), Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô lỏng;

- TCVN 6831-3:2010 (ISO 11348-3:2007), Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông khô.

Lời giới thiệu

Phép đo quy định trong bộ TCVN 6831 (ISO 11348) có thể tiến hành sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy, cũng như vi khuẩn đông khô hoặc khô lỏng.

Công việc tiêu chuẩn hóa do DIN Normenausschuss Wasserwesen và ISO/TC 147/SC 5/WG 1 tiến hành đã cho thấy, trong trường hợp đặc biệt, các kỹ thuật khác nhau này có thể cho kết quả khác nhau, đặc biệt khi có mặt kim loại nặng.

Độ nhạy thay đổi là do sự khác nhau trong thành phần môi trường sử dụng để chuẩn bị vi khuẩn đông khô hoặc khô lỏng. Các môi trường bảo vệ này ảnh hưởng đến tính có sẵn sinh học của các chất độc và/hoặc sự phát quang của vi khuẩn phát quang. Điều này có nghĩa là nguồn gốc và phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cần được xem xét khi biểu thị kết quả. Đôi khi, việc này có thể khó khăn, vì vi khuẩn đông khô và khô lỏng có thể do các nhà cung cấp khác nhau. Do vậy, việc này có nghĩa là thành phần chi tiết không được biết và do vậy người sử dụng không thể diễn giải được.

Vì lý do này, ngoài phép đo độc tính dùng vi khuẩn khô lỏng TCVN 6831-2 (ISO 11348-2) và vi khuẩn đông khô TCVN 6831-3 (ISO 11348-3), quy trình dùng vi khuẩn mới nuôi cấy được mô tả trong tiêu chuẩn này, tính năng thực hiện của quy trình có thể do người sử dụng diễn giải trong từng chi tiết.

Phòng thí nghiệm chịu trách nhiệm về kết quả có cơ hội để lựa chọn kỹ thuật phù hợp nhất dựa trên các lời khuyên của chuyên gia và thông tin về mẫu nước thử nghiệm.

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) - PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN MỚI NUÔI CẤY

Water quality - Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) - Part 1: Method using freshly prepared bacteria

CẢNH BÁO - Người sử dụng tiêu chuẩn này cần phải thành thạo với các thực hành trong phòng thí nghiệm thông thường. Tiêu chuẩn này không đề cập tới mọi vấn đề an toàn liên quan đến người sử dụng. Trách nhiệm của người sử dụng là phải xác lập độ an toàn, bảo đảm sức khỏe phù hợp với các quy định của quốc gia.

QUAN TRỌNG - Điều chủ yếu là phép thử theo tiêu chuẩn này cần được tiến hành bởi những nhân viên được đào tạo phù hợp.

1. Phạm vi áp dụng

TCVN 6831:2010 (ISO 11348:2007) quy định ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn biển Vibrio fischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-1:2010 (ISO 11348-1) quy định phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy.

Tiêu chuẩn này áp dụng cho:

- Nước thải;

- Dịch chiết và dịch ngâm chiết bằng nước;

- Nước sạch (nước mặt và nước ngầm);

- Nước mặn và nước lợ;

- Dịch rửa giải của trầm tích (nước ngọt, nước lợ và nước biển);

- Nước giếng khoan;

- Chất ô nhiễm đơn, được pha loãng trong nước.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 7325 (ISO 5814), Chất lượng nước - Xác định oxy hòa tan - Phương pháp đầu đo điện hoá.

TCVN 6184 (ISO 7027), Chất lượng nước - Xác định độ đục.

ISO 5667-16, Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on biotesting of samples (Chất lượng nước - Hướng dẫn thử sinh học các mẫu).

3. Nguyên tắc

Sự ức chế phát quang do cấy vi khuẩn Vibrio fischeri được xác định bằng cách thử nghiệm theo từng mẻ. Điều đó được thực hiện bằng việc kết hợp các thể tích quy định của mẫu thử hoặc mẫu đã pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng trong ống thử.

Chuẩn cứ của phép thử là sự giảm độ phát quang mẫu thử trong suốt thời gian tiếp xúc, cường độ phát quang trong mẫu sẽ được đo sau thời gian phản ứng là 15 min và 30 min hoặc có thể đo thêm sau 5 min, tùy chọn, có tính đến hệ số hiệu chính (f_kt). Ảnh hưởng ức chế của mẫu nước có thể được xác định bằng LID (xem Phụ lục B) hoặc là các giá trị EC₂₀ và/hoặc giá trị EC₅₀ thông qua các dãy pha loãng (EC là nồng độ ảnh hưởng).

4. Các chất gây nhiễu

Các chất không tan, ít tan hoặc dễ bay hơi hoặc các chất có phản ứng với nước pha loãng hoặc với huyền phù, hoặc làm thay đổi trạng thái của chúng trong quá trình thử, có thể ảnh hưởng đến kết quả hoặc làm giảm độ tái lập của kết quả thử.

Trong trường hợp nước quá đục hoặc đậm màu, có thể xảy ra sự mất phát quang do việc hấp thụ ánh sáng hoặc tán xạ ánh sáng gây ra. Sự gây nhiễu này đôi khi có thể khắc phục được bằng cách xử lý độ đục của mẫu (7.2) hoặc, ví dụ, bằng cách sử dụng cuvet hiệu chính hấp thụ hai ngăn (xem Phụ lục A).

Vì sự phát quang sinh học^[6] cần đến oxy, nên các mẫu có nhu cầu oxy cao (và/hoặc có nồng độ oxy thấp) có thể sẽ gây ra sự thiếu hụt oxy và mẫu sẽ bị ức chế.

Các chất dinh dưỡng dễ phân hủy sinh học trong mẫu có thể làm giảm sự tự ô nhiễm trong việc phát quang sinh học^[1].

Mẫu có pH nằm ngoài khoảng từ 6,0 đến 8,5 sẽ ảnh hưởng đến sự phát quang của vi khuẩn ^[6],[7]. Cần phải điều chỉnh pH của mẫu nếu ảnh hưởng độc của pH là không mong muốn.

Vì vi khuẩn thử nghiệm Vibrio fishcheri là vi khuẩn biển, nên việc thử nghiệm các mẫu nước mặn theo quy trình chuẩn thường dẫn đến các hiệu ứng kích thích phát quang sinh học mà có thể che hiệu ứng ức chế (xem Phụ lục D).

Nồng độ muối trong mẫu ban đầu vượt quá 30 g/l NaCI, hoặc hàm lượng các thành phần khác có độ thẩm thấu tương đương, cùng với lượng muối cần phải thêm vào khi thử có thể gây ra các hiệu ứng siêu thẩm thấu. Để tránh ảnh hưởng này, nồng độ muối cuối cùng có trong mẫu thử sẽ không được vượt quá độ thẩm thấu của dung dịch NaCI là 35 g/l.

5. Thuốc thử và các vật liệu

Sử dụng các hóa chất đạt chất lượng tinh khiết phân tích. Dùng nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

5.1. Vi khuẩn thử

Sử dụng chủng vi khuẩn phát quang thuộc loại Vibrio fischeri NRRL B - 11177. Chủng vi khuẩn có thể được mua ngoài thị trường ở dạng thuốc thử đông-khô hoặc khô-lỏng hoặc từ bộ chủng nuôi cấy, ví dụ Deutsche Sammlung fur Mikroganis und Zellkuturen Gmbh, Mascheroder Weg 10, D-38124 Braunschweug, Germany, hoặc NRRL, ARS culture collection NCAUR, 1815 N, University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Các huyền phù vi khuẩn dùng để xác định độc tính cần phải mới được nuôi cấy.

5.2. Dung dịch natri clorua, làm chất pha loãng

Hòa tan 20 g natri clorua (NaCI) trong nước và thêm nước đến 1 lít.

5.3. Dung dịch natri hydroxit, ví dụ c(NaOH) = 1 mol/l.

5.4. Axit clohydric, ví dụ c(HCI) = 1 mol/l.

Để điều chỉnh pH có thể sử dụng các axit hoặc các bazơ nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn.

5.5. Dung dịch dùng cho vi khuẩn mới nuôi cấy

Hòa tan các thành phần trên trong nước, khuấy đều trong 30 min và điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch natri hydroxit (5.3) hoặc bằng axit clohydric (5.4). Thêm nước đến 1 lít.

Dung dịch này có thể bảo quản từng phần và ở nhiệt độ -18 °C tới -20 °C.

5.6. Chất chuẩn

Chuẩn bị riêng rẽ các dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng dung dịch natri clorua (5.2) mà không cần điều chỉnh pH:

Các nồng độ này xấp xỉ gấp hai lần giá trị các EC₅₀ mong đợi đối với các chất chuẩn tương ứng trong tiêu chuẩn này. Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các dung dịch có sẵn ngoài thị trường có nồng độ ZnSO₄ và K₂Cr₂O₇ (titrisol) xác định để chuẩn bị dung dịch gốc của các chất chuẩn.

5.7. Dịch lỏng dùng để cấy sơ bộ và cấy chính

Hòa tan các thành phần trên trong nước và điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch natri hydroxit (5.3) hoặc bằng axit clohydric (5.4). Thêm nước đến 1 lít. Chuyển mỗi lần 50 ml vào bình Erlenmeyer (ví dụ dung tích 250 ml) và khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 °C trong 20 min.

Caso-pepton và cao men do nhiều hãng cung cấp nên có thể có chất lượng khác nhau. Trong trường hợp có trở ngại (ví dụ: ức chế phát triển), thì cần mua sản phẩm của hãng khác.

5.8. Môi trường thạch để cấy vi khuẩn gốc

Điều chỉnh dịch lỏng cấy (5.7) đến pH 7,0 ± 0,2.

Thêm và hòa tan 12 g thạch cho mỗi lít bằng cách làm ấm nhẹ; khử trùng và chuyển sang các đĩa Petri vô khuẩn.

5.9. Môi trường bảo vệ

Hòa tan hoàn toàn các thành phần trên trong nước ở 37 °C, nếu cần dùng natri hydroxit (5.3) hoặc axit clohydric (5.4) để chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng. Thêm nước đến 100 ml.

Sử dụng môi trường bảo vệ để không gây ảnh hưởng đến các tế bào vi khuẩn trong quá trình làm lạnh. BSA do nhiều hãng cung cấp có thể có chất lượng khác nhau. Trong trường hợp có trở ngại thì cần mua sản phẩm của hãng khác.

Chuẩn bị môi trường bảo vệ ngay trước khi sử dụng.

6. Thiết bị, dụng cụ

6.1. Hộp kiểm soát nhiệt độ, để duy trì mẫu thử ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C. Trong mỗi lần thử nghiệm nhiệt độ chỉ được dao động tối đa ± 0,3 °C.

6.2. Bể điều nhiệt hoặc hộp kiểm soát nhiệt độ, để duy trì dung dịch có thể tích ít nhất 12 ml được chuẩn bị trong 5.5 (ví dụ bình thuốc thử) ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C.

6.3. Máy đo độ phát quang, ngăn đo mẫu được duy trì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C, có trang bị các cuvet phù hợp.

6.4. Cuvet thử, làm bằng chất liệu trơ về hóa học, thích hợp để sử dụng với ngăn đo độ phát quang đã chọn và có dung tích tạo thuận lợi để đọc hết bề mặt lớn nhất có thể và phù hợp với hộp kiểm soát nhiệt độ (6.1).

6.5. pH-mét.

6.6. Đồng hồ tính giờ.

6.7. Pipet pittông hoặc bơm tiêm nhựa, 10 ml, 500 ml và 1000 ml.

6.8. Pipet pittông có dung tích có thể thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml và 200 ml đến 5000 ml.

6.9. Máy li tâm lạnh.

6.10. Máy khuấy từ và que khuấy từ.

6.11. Tủ ấm lắc rung, để ủ các bình Erlenmeyer.

6.12. Nồi hấp.

6.13. Tủ ủ.

6.14. Máy đo phổ hoặc máy đo quang kính lọc và cuvet, có chiều dài quang học 1 cm.

6.15. Vòng cấy (hoặc kim cấy).

6.16. Máy đo độ dẫn.

6.17. Tủ lạnh sâu, để bảo quản dung dịch và huyền phù.

6.18. Đầu đo oxy, Theo TCVN 7325 (ISO 5814).

7. Lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu

7.1. Lấy mẫu

Mẫu phải được đựng trong các vật chứa sạch, trơ về hóa học như quy định tại ISO 5667-16. Nạp đầy mẫu vào vật chứa và gắn kín. Thử nghiệm mẫu càng sớm càng tốt ngay sau khi lấy mẫu. Nếu cần, bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 °C đến 5 °C trong vật chứa ở nơi tối không quá 48 h. Nếu phải bảo quản mẫu đến hai tháng thì để mẫu ở nhiệt độ ≤ -18 °C. Không được sử dụng hóa chất để bảo quản mẫu. Cần chỉnh -pH và thêm muối trước khi thử.

7.2. Chuẩn bị mẫu

Đo nồng độ oxy trong tất cả các mẫu. Nồng độ oxy cần phải > 3 mg/l đối với thử nghiệm này. Nếu nồng độ oxy của mẫu chưa pha loãng nhỏ hơn 3 mg/l, thì phải sử dụng phương pháp làm đủ oxy cho mẫu, ví dụ sục khí hoặc khuấy.

Đo pH của tất cả các mẫu. Nếu pH trong khoảng từ 6,0 đến 8,5 thì không cần phải điều chỉnh. Tuy nhiên, việc chỉnh giá trị pH có thể làm biến đổi bản chất của mẫu. Mặt khác, pH của mẫu và pH của mẻ thử có thể khác nhau do khả năng đệm của môi trường thử. Có thể cần phải thực hiện thử nghiệm trên cả hai mẫu: mẫu đã điều chỉnh-pH và mẫu chưa điều chỉnh-pH.

Nếu cần, điều chỉnh-pH của mẫu bằng cách thêm axit clohydric (5.4) hoặc dung dịch natri hydroxit (5.3). Tùy thuộc vào mục đích của phép thử có thể điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 hoặc giới hạn trên (8,5 ± 0,2) và giới hạn dưới (6,0 ± 0,2). Lựa chọn nồng độ của axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit sao cho thể tích thêm vào không lớn hơn 5 % tổng thể tích.

Cho thêm 20 g natri clorua cho mỗi lít vào mẫu nước hoặc vào mẫu nước đã trung hòa.

Đối với mẫu có nồng độ muối cao thì đo độ muối và nếu cần thêm lượng muối để điều chỉnh độ thẩm thấu tới NaCI 20 g/l.

Nếu mẫu chứa từ 20 g/l đến 50 g/l NaCI tương đương, không cần thêm muối. Nồng độ muối tạo nên trong mẫu thử không được vượt quá độ thẩm thấu 35 g/l dung dịch natri clorua.

Phụ lục D cung cấp thêm các thông tin đối với những mẫu nước mặn.

Các mẫu quá đục cần được để lắng trong 1 h hoặc cho ly tâm, ví dụ trong 10 min ở 5000 g hoặc lọc. Sử dụng chất nổi hoặc cái lọc cho phép thử.

8. Cấy vi khuẩn phát quang

8.1. Cấy vi khuẩn gốc

Chuyển vi khuẩn phát quang chủng Vibrio fischeri NRRL B-11177 (5.1), trong các điều kiện vô khuẩn sang các đĩa Petri chứa môi trường thạch dùng nuôi cấy vi khuẩn gốc (5.8).

Ủ trong tủ ấm từ 2 ngày đến 3 ngày ở nhiệt độ 20 °C ± 1 °C.

Đánh dấu các khuẩn lạc riêng lẻ phát quang bằng cách quan sát bằng mắt trong bóng tối, và bảo quản các đĩa trong tủ lạnh.

Chuyển các khuẩn lạc đã đánh dấu trong điều kiện vô khuẩn sang các đĩa mới sau thời gian bảo quản mỗi tuần và tối đa là hai tuần.

Các lọ vi khuẩn được bảo quản có bán sẵn thường không được phân phối dưới các điều kiện vô khuẩn. Để nuôi cấy vi khuẩn tinh khiết nên dùng một vài chủng khuẩn lạc đơn. Để tránh biến đổi tính di truyền, có thể mở và sử dụng lọ vi khuẩn đã được bảo quản 6 tháng một lần.

CHÚ THÍCH: Độ phát quang của các khuẩn lạc phát quang có thể bị giảm trong quá trình bảo quản.

8.2. Chuẩn bị nuôi cấy sơ bộ

Dưới các điều kiện vô trùng, cho 50 ml dịch lỏng nuôi cấy sơ bộ (5.7) vào các bình tam giác (dung tích khoảng 250 ml) đã có một khuẩn lạc đơn lẻ phát quang của chất cấy gốc đã ủ từ 2 ngày đến 3 ngày.

Lắc trong 21 h ± 1 h ở 20 °C ± 1 °C với ít nhất 180 r.min^-1.

Xác định độ đục của dịch pha loãng 1 phần 10 chất cấy trong dung dịch natri clorua (5.2), ví dụ, ở 578 nm, tính bằng đơn vị hấp thụ formazin (FAU), như quy định tại TCVN 6184 (ISO 7027).

8.3. Chuẩn bị nuôi cấy chính

Cho 50 ml dịch lỏng nuôi cấy chính (5.7) với một thể tích thích hợp chất cấy sơ bộ (8.2) vào các bình tam giác 250 ml sao cho có được độ đục ước tính ban đầu là 10 đơn vị FAU.

Lắc trong 20 h ± 1 h ở 20 °C ± 1 °C với ít nhất là 180 r.min^-1.

Xác định độ đục, tính bằng FAU, của dịch pha loãng 1 phần 10 trong dung dịch natri clorua (5.2) bằng đo quang ở 578 nm.

CHÚ THÍCH: Khi tuân thủ các điều kiện nêu trên, chất cấy chính không pha loãng thường cho độ đục từ 700 FAU đến 1 800 FAU.

8.4. Chuẩn bị huyền phù gốc

Làm lạnh sơ bộ dung dịch natri clorua (5.2) và môi trường bảo vệ (5.9) trong đá.

Ly tâm huyền phù vi khuẩn thu được từ dung dịch cấy chính (8.3) ở nhiệt độ 4 °C ± 2 °C bằng máy ly tâm đã được làm lạnh trước, từ 15 min đến 20 min ở 6000 g ± 2000 g.

Đối với mỗi 50 ml chất cấy chính, gạn bỏ phần nổi ở trên và hòa phần cặn trong 5 ml đến 10 ml dung dịch natri clorua đã làm lạnh trước (5.2).

Ly tâm lại như điều kiện ở trên.

Đối với 50 ml chất cấy chính, gạn bỏ phần nổi ở trên và hòa phần cặn trong 0,5 ml dung dịch natri clorua đã làm lạnh trước (5.2).

Chuyển huyền phù vi khuẩn vào cốc thí nghiệm (ví dụ. dung tích 100 ml) đã làm lạnh trước và đặt cốc lên đá lạnh.

Thêm từ từ khoảng 4 ml cho mỗi 50 ml chất cấy chính môi trường bảo vệ (5.9) dưới điều kiện làm lạnh liên tục bằng nước đá và khuấy đều.

Tiến hành xác định độ đục của dịch pha loãng 1 phần 100 với dung dịch natri clorua (5.2) bằng phương pháp đo quang.

Thêm thật nhanh môi trường bảo vệ đã làm lạnh trước (5.9) cho đến khi đạt độ đục ước tính 2500 FAU ± 500 FAU hoặc tương đương (xem Chú thích tại 8.1).

Để chuẩn bị huyền phù gốc thích hợp, cứ mỗi mililit huyền phù trong dung dịch natri clorua nên cho thêm ít nhất 10 ml môi trường bảo vệ. Khi cho thêm môi trường bảo vệ thì độ phát quang sinh học sẽ bị giảm rõ rệt, nhưng nó sẽ xuất hiện lại sau khi thêm dung dịch pha loãng.

Tiếp tục khuấy trong 15 min để thu được hỗn hợp đồng nhất.

Cho hỗn hợp này vào các cuvet thử thích hợp (6.4), mỗi cuvet 100 ml.

Để thuận tiện nên dùng loại cuvet được sử dụng trong quy trình tiếp sau (Điều 9).

Để sử dụng sau này, bảo quản huyền phù gốc trong tủ đá ở ≤ -20 °C.

CHÚ THÍCH: Huyền phù gốc có thể được sử dụng trong vài tháng. Huyền phù có thể được bảo quản lâu hơn ở nhiệt độ -70 °C.

Các huyền phù gốc được rã đông chỉ có thể dùng cho các thử nghiệm sơ bộ.

Có thể sử dụng huyền phù gốc vào mục đích thử nghiệm miễn là thỏa mãn các chuẩn cứ về tính đúng đắn (xem Điều 12).

9. Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu chuẩn theo 5.6. Thử nghiệm mỗi mẻ vi khuẩn với cả ba mẫu chuẩn. Thử ít nhất một trong ba mẫu chuẩn song song với mỗi cuvet dung dịch huyền phù gốc cho mỗi phép thử.

Chuẩn bị mẫu theo 7.2.

Lấy ống có chứa huyền phù gốc (8.4) ra ngoài tủ lạnh sâu và đặt vào bể điều nhiệt ở 20 °C ± 2 °C để làm tan huyền phù.

Chuẩn bị huyền phù thử theo hai bước:

- Thêm 0,5 ml dung dịch (5.5) cho từng 100 ml huyền phù gốc vào cuvet thử, duy trì ở nhiệt độ 15°C ± 1 °C và làm đồng nhất bằng cách lắc nhẹ cuvet thử.

- Chờ khoảng 15 min.

Dùng pipet hút dung dịch huyền phù này rồi cho vào bình định mức, ví dụ dung tích 20 ml, và thêm 11,5 ml dung dịch (5.5), duy trì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C, và làm đồng nhất bằng cách lắc nhẹ bình thuốc thử.

Chờ khoảng 15 min.

Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng mẫu, mẫu chuẩn (5.6) và mẫu kiểm soát (5.2) vào một bộ cuvet thử thứ nhất (6.4).

Quy trình thông thường để chuẩn bị dãy pha loãng được mô tả trong Phụ lục B. Tùy thuộc vào mục đích của thử nghiệm và các yêu cầu thống kê liên quan đến kết quả phép thử, thì các thiết kế dãy pha loãng có nồng độ dãy hình học hoặc logarit có thể cũng phù hợp. Vì hỗn hợp các thể tích bằng nhau của mẫu/mẫu đã pha loãng và huyền phù thử nghiệm, nên nồng độ mẫu cao nhất trong phép thử chiếm 50% mẫu thử như là một quy luật. Đối với phép thử mẫu nước gần như không pha loãng (80 % mẫu), thì cần thêm mẻ kiểm tra (xem B.2 và Bảng 1).

Duy trì các cuvet thử có chứa dung dịch natri clorua (5.2) để kiểm soát, mẫu chuẩn (5.6), mẫu (7.2) và các mẫu của dãy pha loãng (Bảng B.1) ở 15 °C ± 1 °C.

Chọn điều kiện thử nghiệm đảm bảo độ lệch nhiệt độ tối đa trong bể điều nhiệt trong một phép thử là không quá ± 0,3 °C.

Đối với các phép thử có thể tích huyền phù cần thử và mẫu thử bằng nhau, dùng pipet hút vào ống đo thứ hai, tương ứng với cuvet thử (6.4) 500 ml huyền phù cần thử, duy trì ở nhiệt độ 15 °C ± 1 °C trong tủ ấm, trong các khoảng thời gian bằng nhau (từ 5 s đến 20 s) như đối với các phép đo cường độ sau này.

Tiến hành phép xác định song song đối với mỗi mức pha loãng ở nhiệt độ thử 15 °C ± 1 °C.

Điều chỉnh dụng cụ đo huỳnh quang sao cho thuận tiện và gần với mức cực đại.

Xác định và ghi cường độ phát quang, I₀, của các huyền phù thử bằng máy đo phát quang.

Vì thời gian tiếp xúc đối với tất cả các mẫu phải bằng nhau, nên sử dụng đồng hồ tính giờ (6.6) để đo cường độ phát quang ở các khoảng thời gian đo bằng nhau. Khoảng thời gian đo thích hợp là 5 s đến 20 s.

Đo tất cả các huyền phù thử, bởi vì độ phát quang có thể khác nhau do huyền phù thử không được đồng nhất.

Ngay sau khi đo độ phát quang của huyền phù thử ban đầu, làm đầy huyền phù thử này tới 1 ml bằng mẫu (7.2), mẫu đã pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5 6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2), nếu thích hợp. Việc này được thực hiện bằng cách dùng pipet lấy 500 ml mỗi dung dịch mẫu (7.2), mẫu đã pha loãng (Phụ lục B), mẫu chuẩn (5.6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2), đã được chuẩn bị trong dãy cuvet thử thứ nhất, cho vào huyền phù thử cần thử trong mỗi cuvet thử của dãy ống đo thứ hai tương ứng. Lắc đều bằng tay, bắt đầu bấm giờ và đặt các cuvet thử trở lại bể điều nhiệt tại nhiệt độ 15 °C ± 1 °C.

Lặp lại với tất cả các cuvet thử khác, để cùng khoảng thời gian giữa những lần thêm vào.

Đo và ghi cường độ phát quang trong tất cả các cuvet, kể cả mẫu kiểm soát, cứ sau 15 min và sau 30 min (I₁₅, I₃₀), có thể đo sau 5 min (I₅), tùy chọn, để khoảng thời gian đo từ 5 s đến 20 s.

Ghi lại sự điều chỉnh dụng cụ.

10. Đánh giá

10.1. Ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩn phát quang

Sử dụng công thức (1) để tính hệ số hiệu chính (giá trị ) từ cường độ phát quang đo được. Hệ số này dùng để hiệu chính giá trị ban đầu I₀ của tất cả các mẫu thử trước khi chúng được dùng làm giá trị chuẩn cho việc xác định độ giảm phát quang do nước.

(t = 5 min, 15 min, 30 min)                                               (1)

Trong đó

là hệ số hiệu chính đối với thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min, 30 min;

I_kt là cường độ phát quang trong mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng đơn vị phát quang tương ứng;

I₀ là cường độ phát quang của huyền phù thử kiểm tra ngay trước khi cho thêm chất pha loãng (5.2), tính bằng đơn vị phát quang tương ứng;

Tính hệ số hiệu chính trung bình  và độ lệch của các giá trị riêng từ giá trị trung bình tính bằng phần trăm (lấy một chữ số có nghĩa)

                           (2)

Trong đó:

là giá trị riêng của một trong hai hệ số điều chỉnh và  là giá trị trung bình

Dùng công thức (3) để tính I_ct:

                                    (3)

Trong đó:

là giá trị trung bình của ;

I₀ là cường độ phát quang của huyền phù mẫu thử, ngay trước khi thêm của mẫu (7.2) hoặc mẫu pha loãng (Phụ lục B), tính bằng đơn vị phát quang tương ứng;

I_ct là giá trị đã hiệu chính của I₀ đối với các cuvet đựng mẫu thử ngay trước khi cho mẫu thử vào.

Dùng công thức (4) để tính ảnh hưởng ức chế của mẫu thử:

                          (4)

Trong đó:

H_t là ảnh hưởng ức chế của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng phần trăm;

I_ct xem Công thức (3);

I_t là cường độ phát quang của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằng phát quang tương ứng;

Tính giá trị trung bình của ảnh hưởng ức chế H_t cho mỗi mức pha loãng, tính bằng phần trăm.

Tính chênh lệch số học của phép xác định song song H_ti từ trung bình tương ứng , tính bằng điểm phần trăm (một chữ số có nghĩa):

Trong đó

H_ti là một trong hai giá trị hiệu ứng ức chế của mẫu thử và là giá trị trung bình.

10.2. Xác định các giá trị EC

Tính toán mối tương quan ảnh hưởng của nồng độ đối với từng thời gian tiếp xúc sử dụng tuyến tính chuẩn thích hợp hoặc phân tích hồi quy phi tuyến tính^[8].

Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ sử dụng kỹ thuật hồi quy tuyến tính, ước lượng giá trị gamma cho từng mức pha loãng (tỷ lệ của độ giảm phát quang với tổng lượng ánh sáng còn lại tại thời điểm t) sử dụng Công thức (5):

                                          (5)

(Mời xem tiếp trong file tải về)