TCVN 11941:2017 Thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản-Xác định hàm lượng putrescine và cadaverine-Phương pháp sắc ký khí

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11941:2017

THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PUTRESCINE VÀ CADAVERINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Fish and fishery products - Determination of putrescine and cadaverine content - Gas chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11941:2017 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 996.07 Putrescine in Canned Tuna and Cadaverine in Canned Tuna and Mahimahi. Gas Chromatographic Method;

TCVN 11941:2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F11 Thủy sản và sản phẩm thủy sản biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PUTRESCINE VÀ CADAVERINE - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Fish and fishery products - Determination of putrescine and cadaverine content - Gas chromatographic method

CẢNH BÁO - Pentafluoropropionic anhydrit gây cháy mạnh. Tránh để tiếp xúc với da và mắt. Trong quá trình thao tác, mang găng tay và sử dụng dụng cụ loại bỏ khói hiệu quả.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng putrescine và cadaverine trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký khí.

Giới hạn định lượng của putrescine trong cá hồi đóng hộp là 0,3 µg/g. Giới hạn định lượng của cadaverine trong cá hồi và cá nục (mahimahi) là 0,5 µg/g.

Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm được nêu trong Phụ lục A.

2  Nguyên tắc

Putrescine và cadaverine được chiết ra khỏi phần mẫu thử bằng metanol 75 % và sau đó được chuyển hóa thành các dẫn xuất florua. Hỗn hợp phản ứng được tinh sạch bằng cách cho đi qua cột chiết pha rắn (SPE) và các dẫn xuất được định lượng bằng sắc ký khí (GC) với detector bắt giữ điện tử sau khi tách trên cột OV-225.

3  Thuốc thử

Chỉ sử dụng các loại thuốc thử tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước ít nhất là loại 3 theo TCVN 4851:1999 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử, trừ khi có quy định khác.

3.1  Pentafluoropropionic (PFP) anhydrit, được bảo quản lạnh và tránh ẩm.

3.2  Etyl axetat. được chưng cất trong dụng cụ bằng thủy tinh thích hợp cho GC.

3.3  Toluen, được chưng cất trong dụng cụ bằng thủy tinh thích hợp cho GC.

3.4  Hexan, thích hợp cho GC.

3.5  Dung dịch axit clohydric (HCl), 1 M

Pha loãng 83,3 ml axit clohydric đặc (nồng độ 36,5 % đến 38 %) bằng nước đến 1 L.

3.6  Dung dịch axit clohydric (HCl), 0,1 M

Pha loãng 100 ml dung dịch axit clohydric (3.5) bằng nước đến 1 L.

3.7  Dung môi toluen 30 % ety! axetat.

Chuyển 150 ml etyl axetat vào ống đong chia vạch có nắp đậy, thêm 350 ml toluen và trộn đều.

3.8  Metanol, 75 % (phần thể tích)

Cho 750 ml metanol (được chưng cất trong dụng cụ bằng thủy tinh) vào bình định mức 1 L (4.7). Thêm nước đến vạch trong khi xoay bình.

3.9  Dung dịch nội chuẩn hexandiamine

3.9.1  Dung dịch nội chuẩn gốc, 1 µg/l

Hòa tan 163,0 mg hexanediamine dihydroclorua vào dung dịch axit clohydric 0,1 M (3.6) đựng trong bình định mức 100 ml (4.7), thêm axit clohydric 0,1 M đến vạch.

3.9.2  Dung dịch nội chuẩn trung gian, 20 µg/ml

Dùng pipet (4.11) lấy 2 ml dung dịch nội chuẩn gốc hexanediamine (3.9.1) cho vào bình định mức 100 ml (4.7), thêm axit clohydric 0,1 M (3.6) đến vạch.

3.9.3  Dung dịch nội chuẩn làm việc hexanediamine, 5 µg/ml.

Dùng pipet (4.11) lấy 25 ml dung dịch nội chuẩn trung gian 20 µg/ml (3.9.2) cho vào bình định mức 100 ml (4.7), thêm axit clohydric 0,1 M đến vạch.

3.10  Dung dịch chuẩn gốc putrescine-cadaverine

Hòa tan 91,4 mg putrescine dihydroclorua và 171,3 mg cadaverine dihydroclorua vào axit clohydic 0,1 M (3.6) đựng trong bình định mức 100 ml, thêm axit clohydric 0,1 M đến vạch.

3.11  Dung dịch chuẩn làm việc putrescine-cadaverine

3.11.1

Dùng pipet (4.11) lấy 1 ml dung dịch chuẩn gốc putrescine-cadaverine, (3.10), cho vào bình định mức 100 ml (4.7), thêm axit clohydric 0,1 M (3.6) đến vạch.

3.11.2  Dung dịch B, nồng độ cadaverine và putrescine ở dạng gốc tự do là 1 µg/ml và 0,5 µg/ml.

Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch A (3.11.1) cho vào bình định mức 100 ml (4.7), thêm axit clohydric 0,1 M (3.6) đến vạch.

3.12  Dung môi ete dầu mỏ-toluen. 4 + 1 (phần thể tích), để kiểm tra hoạt tính của các ống SPE.

3.13  Dung dịch màu sudan I, để kiểm tra hoạt tính của các ống SPE.

Hòa tan 0,01 g chất màu sudan I (97 %) trong 8 ml dung môi ete dầu mỏ-toluen (3.12).

3.14  Dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine I đến IV

Dùng pipet (4.11) lấy 1 ml dung dịch dung dịch nội chuẩn làm việc hexanediamine (3.9.3) và các thể tích đã biết của dung dịch chuẩn làm việc putrescine-cadaverine (xem Bảng 1) vào bình cầu đáy phẳng hoặc đáy tròn dung tích 100 ml (4.8) riêng rẽ. Thêm khoảng 0,5 ml axit clohydric 1 M (3.5) vào từng bình và làm bay hơi đến khô trên máy cô quay (4.5) ở khoảng từ 50 °C đến 60 °C (với điều kiện ẩm mát và hút chân không đầy đủ để thu được mẫu khô). Tráng mỗi bình với từ 1 ml đến 2 ml nước và tiếp tục làm bay hơi đến khô để loại bỏ hết các vết axit clohydric.

Dùng xyranh thủy tinh (4.14) cho 1 ml etyl axetat (3.2) và 300 µl PFP anhydrit (3.1) vào phần cặn khô. Đậy nắp bình, trộn đều và đun 30 min ở 50 °C trong nồi cách thủy (4.6) (áp suất tăng do phản ứng PFP phát nhiệt, phải vặn chặn nắp).

Khuấy dung dịch ít nhất một lần trong quá trình phản ứng. Sau phản ứng, hỗn hợp phản ứng vẫn phải trong. Trong vòng 2 h sau khi lấy hỗn hợp ra khỏi nồi cách thủy, tiến hành bước tiếp theo để tinh sạch hỗn hợp phản ứng bằng ống SPE.

Thêm 2 ml toluen (3.3) vào hỗn hợp phản ứng PFP-chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine. Thêm 2 ml hexan (3.4) vào từng ống SPE và để tự chảy. Loại bỏ hexan. Thêm 150 µl hỗn hợp phản ứng toluen PFP chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine vào phía trên ống SPE. Bắt đầu thu lấy dịch chảy ra khi bổ sung hỗn hợp. Thêm 3 hoặc 4 giọt dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7) vào ống. Sau khi hỗn hợp chảy qua ống, thêm 2 ml dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7). Bổ sung tiếp 6 ml dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7) (tổng số 8 ml) và thu lấy toàn bộ dịch chảy ra. Dịch thu được bền ít nhất một tuần khi bảo quản trong tủ lạnh.

Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn hiệu chuẩn của putrescine-cadaverine

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

4.1  Máy sắc ký khí, có detector bắt giữ điện tử dạng xung ⁶³Ni.

4.2  Cột sắc ký, dài 1 800 mm, đường kính trong 2 mm, bằng thủy tinh, được nhồi OV-225 3 % (50 % cyanopropylphenyl, 50 % metyl) trên Gas-Chrom Q từ 100 mesh đến 120 mesh hoặc cột mao quản tương đương.

Ổn định cột 2 h bằng dòng khí ở nhiệt độ phòng, tăng nhiệt độ từ từ (khoảng 6 °C/min) đến 240 °C và giữ trong 16 h. Thời gian lưu các dẫn xuất pentafluoropropionic của putrescine, cadaverine và hexanediamine lần lượt là 7 min, 9 min và 12 min.

4.3  Cột chiết pha rắn (SPE), dung tích 3 ml, ví dụ cột chiết pha rắn SupelClean LC-alumina-N.

Kiểm tra hoạt tính của từng lô ống SPE như sau: Cho 2 ml dung môi ete dầu mỏ-toluen (3.12), đi qua ống SPE, sau đó thêm 50 µl vào dung dịch màu sudan I (3.13). Thêm vài giọt dung môi ete dầu mỏ-toluen (3.12) để loại bỏ màu từ đỉnh ống. Cho 3 ml dung môi qua cột. Nếu lớp chất tạo màu vẫn nằm phía trên cách đỉnh ống SPE 4 mm thì lô sản phẩm đáp ứng yêu cầu về làm sạch chất hiệu chuẩn.

4.4  Cân phân tích.

4.5  Máy cô quay, duy trì ở nhiệt độ 50 °C ± 5 °C.

4.6  Nồi cách thủy, duy trì ở nhiệt độ 50 °C ± 5°C và 60 °C ± 5 °C.

4.7  Bình định mức, dung tích 100 ml và 1 L, có nắp đậy thủy tinh.

4.8  Bình cầu đáy tròn hoặc bình cầu đáy phẳng, dung tích 100 ml.

4.9  Ống đong chia vạch, dung tích 100 ml và 500 ml (có nắp đậy bằng thủy tinh).

4.10  Máy trộn, để chuẩn bị mẫu thử.

4.11  Pipet, có thể phân phối chính xác 1, 2, 3, 5,10 và 25 ml.

4.12  Micropipet, phân phối chính xác 50, 150 và 500 µl.

4.13  Giấy lọc gấp nếp.

4.14  Xyranh thủy tinh, dung tích, 1,0 ml, vạch chia 0,01 ml.

5  Cách tiến hành

5.1  Chiết

Chiết mẫu bằng metanol 75 % như sau: Chuyển 10,00 g mẫu vào bình của máy trộn (4.10) và thêm khoảng 60 ml metanol 75 % (3.8). Trộn khoảng 2 min ở tốc độ cao. Chuyển vào bình định mức 100 ml (4.7), tráng nắp và bình trộn với methanol 75 % (3.8) và cho dịch tráng vào bình. Đặt bình trong nồi cách thủy ở 60 °C (4.6) và duy trì trong 15 min. Để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm metanol 75 % (3.8) đến vạch. Trộn đều bằng cách lật ngược bình và lọc qua giấy lọc gấp nếp (4.13). Dịch chiết bằng metanol bền ít nhất 4 tháng khi bảo quản trong tủ lạnh.

Dùng pipet (4.11) lấy 10 ml dịch chiết metanol cho vào bình cầu đáy tròn hoặc đáy phẳng (4.8), thêm 1 ml dung dịch nội chuẩn làm việc hexanediamine (3.9.3) và khoảng 0,5 ml axit clohydric 1 M (3.5). Làm bay hơi đến khô trên máy cô quay (4.5) ở khoảng 50 °C đến 60 °C (Dịch chiết phải được làm bay hơi đến khô, với điều kiện làm mát và hút chân không đầy đủ để thu được mẫu khô). Sau khi dung môi bay hơi hết, thêm 2 ml đến 3 ml nước, khuấy và làm bay hơi tiếp (quá trình này sẽ loại bỏ hết các vết axit clohydric và đảm bảo dịch chiết khô). Cặn khô của dịch chiết metanol (trước khi phản ứng với PFP anhydrit) bền ít nhất 3 ngày.

Dùng xyranh (4.14) cho 1 ml etyl axetat (3.2) và 300 µl PFP anhydrit (3.1) vào cặn khô. Đậy nắp bình, trộn đều và đun 30 min ở 50 °C trong nồi cách thủy (4.6) (áp suất tăng do phản ứng PFP phát nhiệt, phải vặn chặn nắp).

Khuấy dung dịch ít nhất một lần trong suốt quá trình phản ứng. Sau khi phản ứng, hỗn hợp phản ứng chất phân tích sẽ chuyển màu vàng với hầu hết các sản phẩm thủy sản. (Nếu hỗn hợp phản ứng không có màu chứng tỏ có nước trong cặn của dịch chiết metanol. Trong trường hợp này, lặp lại bước làm bay hơi sau đó tiến hành phân tích). Trong vòng 2 h sau khi lấy ra khỏi nồi cách thủy, tiến hành bước tiếp theo để tinh sạch hỗn hợp phản ứng bằng ống SPE.

Thêm 2 ml toluen (3.3) vào hỗn hợp phản ứng PFP-chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine. Thêm 2 ml hexan (3.4) vào từng ống SPE và để tự chảy. Loại bỏ hexan. Thêm 150 µl hỗn hợp phản ứng toluen PFP chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine vào phía trên ống SPE. Bắt đầu thu lấy dịch chảy ra khi bổ sung hỗn hợp. Thêm 3 hoặc 4 giọt dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7) vào ống. Sau khi hỗn hợp chảy qua ống, thêm 2 ml dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7). Bổ sung tiếp 6 ml dung môi toluen 30 % etyl axetat (3.7) (tổng số 8 ml) và thu lấy toàn bộ dịch chảy ra. Dịch thu được bền ít nhất một tuần khi bảo quản trong tủ lạnh.

5.2  Xác định bằng GC

Chỉnh hệ thống GC cho toàn bộ thang đo của máy ghi khi bơm 1 µl dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tạo dẫn xuất putrescine-cadaverine IV (3.14). Đối với các mẫu chứa các chất phân tích ở mức thấp hơn (ví dụ, nồng độ cadaverine từ 0 µg/g đến 5 µg/g), thì pha dung dịch chuẩn hiệu chuẩn tạo dẫn xuất putrescine-cadaverine III (5 µg/g) trên toàn thang đo.

Bơm 1 µl đến 2 µl dịch thu được từ 5.1 lên hệ thống GC.

CHÚ THÍCH; Chỉ yêu cầu hiệu chuẩn toàn bộ hệ thống bằng GC cách bơm lặp lại từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putresdne-cadaverine ngay khi bắt đầu phân tích trừ khi thiết bị tắt trong khi phân tích. Khi phân tích phần mẫu thử trong ngày tiếp theo, cho chạy lại dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine II và III tạo dẫn xuất qua hệ thống GC để đảm bảo việc hiệu chuẩn thiết bị là ổn định).

6  Tính kết quả

6.1  Tỷ số đáp ứng của cadaverine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn

Tỷ số đáp ứng của cadaverine (RS_c) trong từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine được tính bằng Công thức (1):

                                                                                                   (1)

Trong đó

PS_c là chiều cao pic của PFP cadaverine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine;

PS_h là chiều cao pic của PFP hexanediamine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine.

Dựng đồ thị RS_c theo số microgam cadaverine được tạo dẫn xuất.

6.2  Tỷ số đáp ứng của putrescine trong từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn

Tỷ số đáp ứng của putrescine (RS_p) trong từng dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine được tính bằng Công thức (2):

                                                                                                  (2)

Trong đó

PS_p là chiều cao pic của PFP putrescine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine;

PS_h là chiều cao pic của PFP hexanediamine trong dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine.

Dựng đồ thị RS_p theo số microgam putrescine được tạo dẫn xuất.

6.3  Tỷ số đáp ứng của cadaverine trong dung dịch mẫu thử

Tỷ số đáp ứng của cadaverine, RT_c, trong dung dịch mẫu thử được tính bằng Công thức (3):

                                                                                              (3)

Trong đó

PT_c là chiều cao pic của PFP-cadaverine trong dung dịch thử;

PT_h là chiều cao pic của PFP-hexanediamine trong dung dịch thử.

6.4  Tính tỷ số đáp ứng của putrescine trong dung dịch mẫu thử

Tỷ số đáp ứng của putrescine trong dung dịch thử (RT_p) được tính bằng Công thức (4), sử dụng chiều cao pic của putrescine trong dung dịch thử (PT_p).

                                                                                            (4)

Trong đó

PT_p là chiều cao pic của PFP-putrescine trong dung dịch thử;

PT_h là chiều cao pic của PFP-hexanediamine trong dung dịch thử.

6.5  Tính hàm lượng cadaverine

Hàm lượng cadaverine trong phần mẫu thử, X₁, tính bằng microgam trên gam (µg/g) được tính bằng Công thức (5):

                                                                                (5)

Trong đó

W_c là số microgam cadaverine đã tạo dẫn xuất;

F là hệ số pha loãng, nếu có;

W_t là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

Báo cáo kết quả đến 0,1 µg/g.

6.6  Tính hàm lượng của putrescine

Hàm lượng putrescine trong phần mẫu thử, X₂, tính bằng microgam trên gam (µg/g) được tính bằng Công thức (6):

                                                                          (6)

Trong đó

W_p là số microgam putrescine đã tạo dẫn xuất;

F là hệ số pha loãng, nếu có;

W_t là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

Báo cáo kết quả đến 0,1 µg/g.

CHÚ THÍCH  Nếu giá trị thu được đối với putrescine và cadaverine trong phần mẫu thử cao hơn so với giá trị thu được đối với putrescine và cadaverine với hầu hết dung dịch chuẩn hiệu chuẩn putrescine-cadaverine đậm đặc, thì định lượng mức putrescine và cadaverine trong phần mẫu thử bằng cách phân tích một lượng dịch chiết bằng methanol 75 % nhỏ hơn (ví dụ 1 ml) và nhân với hệ số thích hợp để tính các giá trị biểu thị bằng microgam trên gam. Có thể bơm dung dịch thử với thể tích nhỏ hơn hoặc có thể điều chỉnh thiết bị để ước tính hàm lượng putrescine và cadaverine.

7  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm

Bảng A.1 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định hàm lượng putrescine trong cá ngừ đóng hộp bằng sắc ký khí^a

Bảng A.2 - Các kết quả nghiên cứu liên phòng thử nghiệm để xác định hàm lượng cadaverine trong cá ngừ đóng hộp và cá nục đóng hộp bằng sắc ký khí^a

Bảng A.3 - Độ thu hồi putrescine được bổ sung vào cá ngừ đóng hộp^a

Bảng A.4 - Độ thụ hồi cadaverine được bổ sung vào cá ngừ đóng hộp^a