TCVN 8160-4:2009 Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit-Phương pháp xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong sản phẩm thịt bằng sắc ký trao đổi ion

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8160-4:2009

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT – PHẦN 4: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ NITRIT TRONG SẢN PHẨM THỊT BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 4: Ion-exchange chromatographic (IC) method for the determination of nitrate and nitrite content of meat products

Lời nói đầu

TCVN 8160-4:2009 hoàn toàn tương đương với EN 12014-4:2005;

TCVN 8160-4:2009 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm và Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN Thực phẩm – Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit bao gồm các phần sau:

- TCVN 7814:2007 (EN 12014-2:1997), Thực phẩm – Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit – Xác định hàm lượng nitrat trong rau và sản phẩm rau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao/trao đổi ion.

- TCVN 8160-4:2009 (EN 12014-4:2005), Thực phẩm – Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit – Phần 4: Phương pháp xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong sản phẩm thịt bằng sắc ký trao đổi ion.

Bộ tiêu chuẩn EN 12014 Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content còn có các phần sau:

- EN 12014-1:1997/A1:1999, Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 1: General considerations

- EN 12014-3:2005, Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 3: Spectrometric determination of nitrate and nitrite content of meat products after enzymatic reduction of nitrate to nitrite.

- EN 12014-5:1997, Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 5: Enzymatic determination of nitrate content of vegetable-containing food for babies and infants.

- EN 12014-7:1998, Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 7: Continuous flow method for the determination of nitrate content of vegetables and vegetable products after cadmium reduction.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT – PHẦN 4: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ NITRIT TRONG SẢN PHẨM THỊT BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 4: Ion-exchange chromatographic (IC) method for the determination of nitrate and nitrite content of meat products

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nitrat và nitrit trong sản phẩm thịt bằng sắc ký trao đổi ion (IC), phương pháp này đã được khảo nghiệm đối với các sản phẩm thịt khác nhau có chứa hàm lượng nitrat từ 50 mg/kg đến 300 mg/kg tính theo ion nitrat và hàm lượng nitrit khoảng 40 mg/kg tính theo ion nitrit.

CHÚ THÍCH: Các dữ liệu khảo nghiệm thu được từ các nghiên cứu trong phòng thử nghiệm cho thấy rằng phương pháp này có thể dùng để xác định nitrat trong rau và thực phẩm dành cho trẻ nhỏ, xem [1], [2]. Ngoài ra, phương pháp này có thể dùng để xác định hàm lượng nitrit trong các sản phẩm thịt cao hơn 40 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3. Nguyên tắc

Nitrat và nitrit được chiết ra khỏi mẫu thử bằng nước nóng. Dung dịch nước được xử lý bằng axetonitril để loại bỏ các chất gây nhiễu. Hàm lượng nitrat và nitrit của dung dịch sau đó được xác định bằng sắc ký trao đổi ion (IC) và detector tử ngoại (UV) ở bước sóng 205 nm.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng tối thiểu phải là loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có qui định khác. Khi chuẩn bị các dung dịch, phải tính đến độ tinh khiết của các thuốc thử

4.2. Axetonitril.

4.3. Glyxerol.

4.4. Liti hydroxit dạng khan, hoặc liti hydroxit ngậm một phân tử nước.

4.5. Axit boric, 99 % khối lượng.

4.6. Axit clohydric, c(HCl) = 1,8 mol/l^[1]

Pha loãng 15 ml axit clohydric p₂₀ (HCl)= 1,18 g/ml trong bình định mức 100 ml và thêm nước đến vạch và trộn.

4.7. Axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l.

Pha loãng 5 ml axit clohydric (4.6) trong bình định mức 100 ml và thêm nước đến vạch và trộn.

4.8. Dung dịch gốc nitrat và nitrit

Hòa tan khoảng 1,500 g natri nitrit và 3,258 g kali nitrat trong nước đựng trong bình định mức 1000 ml, thêm nước đến vạch và trộn kỹ. Khi được bảo quản ở 4 ^oC dung dịch này có thể bền được đến 2 tuần.

Natri nitrit là chất hút ẩm.

4.9. Dung dịch chuẩn nitrat và nitrit

Dùng pipet lấy 0 ml, 0,1 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml và 2,0 ml, tương ứng của dung dịch gốc (4.8) cho vào sáu bình định mức 200 ml, thêm nước đến vạch và trộn. 1 l các dung dịch này chứa tương ứng 0 mg, 0,5 mg, 2,5 mg, 5,0 mg, 7,5 mg và 10 mg ion nitrit và 0 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 15 mg và 20 mg ion nitrat. Khuyến cáo chuẩn bị các dung dịch này trong ngày làm việc.

4.10. Dung dịch axit gluconic^[2] , được làm sạch trên cột chiết pha rắn (5.9)

Pha loãng 50 g axit gluconic trong bình định mức 100 ml và thêm nước đã loại khoáng đến vạch và trộn.

CHÚ THÍCH Axit gluconic đôi khi có màu nâu đậm. Trong trường hợp này nên làm trong cho đến khi thu được màu vàng nhạt. Nhìn chung hai cột cần được hoạt hóa với metanol.

4.11. Dung dịch đệm liti borat gluconat

Cho 34,00 axit boric (4.5) và 19,6 ml dung dịch axit gluconic (4.10) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1000 ml. Hòa tan hoàn toàn trong dung dịch 11,00 g liti hydroxit khan hoặc 19,26g liti hydroxit ngậm một phân tử nước (4.4). Thêm 125 ml gyxerol (4.3), thêm nước đến vạch và trộn kỹ. Khi được bảo quản ở 4 ^oC dung dịch này có thể bền được đến 6 tháng.

4.12. Pha động

Cho 17 ml dung dịch đệm (4.11) và 125 ml axetonitril (4.2) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1000 ml. Thêm nước đến vạch và trộn kỹ.

Dùng axit clohydric (4.6 sau đó 4.7) để chỉnh pH đến 6,5 ± 0,1. Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ khoảng 0,22 (5.6). Dung dịch này có thể bền không quá một tuần và pH phải được kiểm tra hàng ngày trước khi sử dụng. Nếu pH nằm ngoài dải qui định thì chuẩn bị dung dịch mới.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.2. Thiết bị đồng hóa, bằng cơ hoặc bằng điện, có thể đồng hóa được mẫu thử, gồm có máy cắt tốc độ cao hoặc máy xay có tấm đục lỗ với đường kính lỗ không quá 4,5 mm và một bộ trộn.

5.3. Máy khuấy từ (tùy chọn).

5.4. Máy lọc gấp nếp (không chứa nitrat/nitrit), cần cẩn thận khi chọn giấy lọc vì một số loại giấy lọc hấp thụ nitrat.

5.5. Màng lọc, dùng cho dung dịch nước và dung dịch axetonitril, có cỡ lỗ khoảng 0,45 .

5.6. Màng lọc, dùng cho dung dịch nước và dung dịch axetonitril, có cỡ lỗ khoảng 0,22 .

5.7. Giá đỡ cho bộ lọc màng, có xyranh thích hợp.

5.8. Máy đo pH.

5.9. Cột chiết pha rắn RP C₁₈, có xyranh thích hợp (tùy chọn).

5.10. Thiết bị IC, gồm các bộ phận sau đây:

5.10.1. Bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao đẳng dòng, với detector UV có thể đo được ở bước sóng 205 nm và bộ phận đánh giá (ví dụ: bộ tích phân có máy vẽ đồ thị)

5.10.2. Cột tách phân tích, trao đổi anion, kích thước 4,6 mm x 150 mm, vật liệu nhồi: resin polymethacrylat với nhóm chức amoni bậc bốn, cỡ hạt 10 , dung lượng (30 ± 3) eq/ml với cột trước, ví dụ: 20 mm, có cùng vật liệu nhồi để bảo vệ cột phân tích.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu

Đồng hóa mẫu thử nghiệm trong thiết bị thích hợp (5.2). Chú ý không để nhiệt độ của mẫu tăng cao quá 25^oC. Nếu sử dụng máy xay, thì cho xay mẫu ít nhất hai lần. Cân 10 g mẫu đã đồng hóa, chính xác đến 10 mg (phần mẫu thử) cho vào bình nón cổ rộng 150 ml.

6.2. Chiết mẫu và làm sạch

Thực hiện phép phân tích trong ngày làm việc.

Cho 50 ml nước có nhiệt độ từ 50 ^oC đến 60 ^oC vào phần mẫu thử trong bình nón cổ rộng. Trộn kỹ bằng thiết bị đồng hóa (5.2). Tráng thiết bị đồng hóa bằng nước và cho nước rửa vào bình. Chuyển hết mẫu sang bình định mức 200 ml, dùng nước để tráng bình. Thêm 50 ml axetonitril (4.2). Trộn nhẹ nhàng. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm nước đến vạch.

Lọc lần thứ nhất qua giấy lọc gấp nếp (5.4) sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ khoảng 0,45 (5.5). Nếu dung dịch đã trong thì có thể bơm mẫu. Nếu dung dịch chưa trong thì lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,22 (5.6) (dung dịch mẫu thử). Chuẩn bị mẫu thử trắng bằng cách thay phần mẫu thử bằng 10 ml nước.

6.3. Chuẩn bị đường chuẩn

Để dựng đường chuẩn, trước tiên bơm các thể tích bằng nhau của các dung dịch chuẩn (4.9), sau đó bơm dung dịch trắng (đã chuẩn bị trong 6.2) với các điều kiện như trong 6.4.1.

Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn.

6.4. Phương pháp xác định

6.4.1. Điều kiện vận hành IC

Nếu sử dụng cột qui định trong 5.10.2 thì phải thỏa mãn các thông số sau đây:

6.4.2. Đo IC

Trước tiên bơm các dung dịch chuẩn (4.9) sau đó bơm các dung dịch mẫu thử trắng và mẫu thử với các điều kiện nêu trong 6.4.1. Khi tiến hành các dãy phân tích, thì cứ năm mẫu thử bơm một mẫu chuẩn.

Nếu pic thu được của mẫu nằm ngoài phạm vi đường chuẩn, thì pha loãng dung dịch mẫu thử trong pha động và lặp lại bước phân tích.

Nhận dạng pic nitrat hoặc nitrit bằng cách so sánh các thời gian lưu đối với dung dịch chuẩn (4.9) và các dung dịch mẫu thử (6.2).

Đọc hàm lượng nitrat hoặc nitrit của dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn.

Kiểm tra giá trị mẫu trắng để đảm bảo rằng trong quá trình chuẩn bị mẫu thử không bị nhiễm nitrat và/hoặc nitrit.

6.5. Tính và biểu thị kết quả

Tính hàm lượng nitrit trong mẫu, w_(NO^-₂₎, được biểu thị bằng miligam ion trên kilogam theo công thức (1):

w_(NO^-₂₎ =  (1)

trong đó:

 là giá trị của nitrit đọc được từ đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít (mg/l);

200 là thể tích phần mẫu thử đã pha loãng (xem 6.2), tính bằng mililít (ml);

m là khối lượng phần mẫu thử ban đầu, tính bằng gam (g).

F là hệ số pha loãng;

Làm tròn kết quả đến số nguyên.

Tính hàm lượng nitrat trong mẫu, w_(NO^-₃₎, được biểu thị bằng miligam ion trên kilogam theo công thức (2):

w_(NO^-₃₎ =  (2)

trong đó:

 là giá trị của nitrat đọc được từ đường chuẩn, tính bằng miligam trên lít (/l);

200, m và F: xem trong Công thức 1.

Làm tròn kết quả đến số nguyên.

7. Độ chụm

7.1. Yêu cầu chung

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm của phương pháp này được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ của chất phân tích và chất nền khác với các giá trị nêu trong Phụ lục B.

7.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, được phép vượt quá giá trị giới hạn lặp lại r sau đây nhưng không quá 5 % trường hợp:

Các giá trị đó là:

7.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, được phép vượt quá giá trị giới hạn tái lập R sau đây nhưng không quá 5 % trường hợp:

Các giá trị đó là:

7.4. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp được sử dụng;

c) kết quả thu được và đơn vị tính;

d) ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

e) ngày nhận mẫu;

f) ngày thử nghiệm;

g) nếu độ lặp lại đã được kiểm tra thì nêu kết quả thu được;

h) mọi điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

i) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong phương pháp này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

VÍ DỤ VỀ SẮC ĐỒ IC CỦA THỊT BÒ MUỐI (MẪU TỪ PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM)

CHÚ DẪN

1 = Nitrit, 38,9 mg/kg khối lượng tại thời gian lưu 12,63 min.

2 = Nitrat, 289,6 mg/kg khối lượng tại thời gian lưu 20,73 min.

Hình A.1 – Ví dụ về sắc độ IC của thịt bò muối

(Mẫu được lấy từ phép thử liên phòng thử nghiệm)

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Các thông số trong Bảng B.1 sau đây đã thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần) [3], do Centre Technique de la Salaison, de la Charcuterie et des Converves de Viandes (CTSCCV), Pháp thực hiện.

Bảng B.1 – Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Phương pháp này cũng đã được đánh giá hiệu lực trong hai phép thử liên phòng thử nghiệm do Cục Thực phẩm Quốc gia Thụy Điển thực hiện năm 1998 [5].

Các kết quả nghiên cứu của cộng tác I của NMKL do 13 phòng thử nghiệm của Cộng đồng Châu Âu thực hiện (Bảng B.2).

Bảng B.2 – Các kết quả nghiên cứu cộng tác I của NMKL

Các kết quả nghiên cứu cộng tác của NMKL II do 15 phòng thử nghiệm của Cộng đồng Châu Âu (Bảng B.3)

Bảng B.3 – Các kết quả nghiên cứu cộng tác II của NMKL

PHỤ LỤC C

(Tham khảo)

KHẢ NĂNG ÁP DỤNG TIẾP THEO

C.1. Yêu cầu chung

Kinh nghiệm cho thấy rằng phương pháp này có thể áp dụng để xác định nitrat trong các chất nền không phải là sản phẩm thịt. Việc chuẩn bị mẫu cần được điều chỉnh như sau:

C.2. Rau và thức ăn cho trẻ nhỏ

Cho 50 ml nước ở nhiệt độ từ 50 ^oC đến 60 ^oC vào phần mẫu thử đựng trong bình cổ rộng và trộn kỹ sử dụng máy khuấy từ (5.3) trong 10 min.

Thêm 50 ml axetonitril (4.2), lắc kỹ rồi để yên 10 min. Chuyển hết hỗn hợp này sang bình định mức 200 ml, tráng cổ bình bằng nước. Thêm nước đến vạch.

Lọc lần thứ nhất qua giấy lọc gấp nếp (5.4) sau đó lọc qua bộ lọc màng có cỡ lỗ khoảng 0,45 (5.5). Nếu dung dịch đã trong thì có thể bơm mẫu. Nếu dung dịch chưa trong thì lọc qua bộ lọc mảng cỡ lỗ 0,22  (5.6) (dung dịch mẫu thử). Chuẩn bị mẫu trắng bằng cách thay phần mẫu thử bằng 10 ml nước.

C.3. Độ chụm

C.3.1. Yêu cầu chung

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm của phương pháp này đối với các chất nền khác được nêu trong Bảng C.1 và C.2. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ của chất phân tích và chất nền khác với giá trị nêu trong Bảng C.1 và C.2.

C.3.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, được phép vượt quá giá trị giới hạn lặp lại r sau đây nhưng không quá 5 % trường hợp:

Các giá trị đối với nitrat tính theo ion nitrat là:

C.3.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm khác nhau thực hiện, được phép vượt quá giới hạn tái lập R sau đây nhưng không quá 5 % trường hợp:

Các giá trị đối với nitrat tính theo ion nitrat là:

C.3.4. Các dữ liệu về độ chụm tiếp theo

Các thông số trong Bảng C.1 sau đây đã thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần) [3], do Centre Technique de la Salaison, de la Charcuterie et des Converves de Viandes (CTSCCV), Pháp thực hiện.

Bảng C.1 – Dữ liệu về độ chụm tiếp theo từ CTSCCV

Hai phép thử bổ sung đã được Cục thực phẩm quốc gia Thụy Điển thực hiện năm 1998 [5] cho các chi tiết trong (Bảng C.2).

Bảng C.2 – Dữ liệu về độ chụm tiếp theo từ CTSCCV

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bulletin de liaison du Centre Technique de la Salaison. De la Charcuterie el des Conserves de Viandes CTSCCV 7. Avenue du General de Gaulle, F-94700 Maisons Alfort. Vol. 5. No 1, 1995.

[2] Congers Sep 95 chromatographies et techniques apparentees. Poster A 90. avaliable from Euradif-B.P.11-38243 Meylan Cede^*. France.

[3] TCVN 6910 (ISO 5725) (tất cả các phần), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo.

[4] Horwilz, W,: International coordination and validation ol analytical methods. In; Food Additives Conlaminants, 1993. Vol 10. No 1.61-69.

[5] Menno el al.: Liquid Chromatographic Determination of Residual Nitrite/Nitrate in Foods: NMKL Collaborative Study. In: Journal of AOAC Internationl. 2000. Vol 83, No2. 365 - 375.

[6] EN 12014-1, Foodstuffs – Determination of nitrate and/or nitrite content – Part 1: General considerations.