TCVN 8171-2:2009 Xác định dư lượng N-metylcarbamat-Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có làm sạch trên cột diatomit

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8171-2:2009

THỰC PHẨM KHÔNG CHỨA CHẤT BÉO – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG N-METYLCARBAMAT – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH TRÊN CỘT DIATOMIT

Non-fatty food – Determination of N-methylcarbamate residues – Part 2: High performance liquid chromatographic (HPLC) method with clean-up on diatomaceous earth column

Lời nói đầu

TCVN 8171-2:2009 hoàn toàn tương đương với EN 14185-2:2006;

TCVN 8171-2:2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8171 (EN 14185) Thực phẩm không chứa chất béo – Xác định dư lượng N-metylcarbamat gồm các phần sau đây:

- TCVN 8171-1:2009 (EN 14185-1:2003), Phần 1: Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao có làm sạch bằng chiết pha rắn.

- TCVN 8171-2:2009 (EN 14185-2:2006), Phần 2: Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao có làm sạch trên cột diatomit.

THỰC PHẨM KHÔNG CHỨA CHẤT BÉO – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG N-METYLCARBAMAT – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH TRÊN CỘT DIATOMIT

Non-fatty food – Determination of N-methylcarbamate residues – Part 2: High performance liquid chromatographic (HPLC) method with clean-up on diatomaceous earth column

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật N-metylcarbamat trong rau và quả bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dựa trên phương pháp Krause [1].

Phương pháp này đã được thẩm định trong nghiên cứu cộng tác về các hợp chất gốc của aldicarb, carbofuran, furathiocarrb, methomyl, oxamyl, propoxur và thiodicarb và các chất chuyển hóa aldicarb sulfoxide, aldicarb sulfon (aldoxycarb) và 3-hydrory-carbofuran trong cà chua và cam ở các mức từ 0,04 mg/kg đến 0,25 mg/kg.

Chưa có các dữ liệu về hiệu năng của phương pháp trong xác định các hợp chất khác cho dù đã biết rằng phương pháp không tốt đối với benfuracarb.

2. Nguyên tắc

Mẫu được đồng hóa với diclometan và mẫu đã đồng hóa được lọc và dịch lọc được làm bay hơi. Riêng đối với mẫu cam chanh, thì mẫu được đồng hóa với axetonitril, dịch lọc được rửa bằng n-hexan và cho bay hơi. Trong cả hai trường hợp, phần còn lại được hòa tan trong dung dịch natri clorua. Chuyển dung dịch sang cột diatomit và rửa giải cột bằng diclometan. Dịch rửa giải được cho bay hơi và cặn được hòa tan trong metanol. Trong dung dịch này, N-metylcarbamat được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo có thủy phân sau cột. Metylamin tạo thành được phản ứng với o-phthaldialdehyd và 2-mercaptoetanol và các dẫn xuất được phát hiện bằng detector huỳnh quang [2].

3. Thuốc thử

3.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, tốt nhất là loại dùng cho HPLC và phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật và nước được sử dụng phải là nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có qui định khác.

Ghi nhãn tất cả các vật chứa thuốc thử chuẩn với tên và độ tinh khiết của thuốc bảo vệ thực vật. Về tên hóa chất và cấu trúc, xem ISO 1750.

3.2. Các khía cạnh an toàn

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

3.3. Axetonitril.

3.4. n-hexan.

3.5. Axetonitril bão hòa n-hexan.

Lắc phễu chiết chứa 400 ml axetonitril (3.3) với 40 ml n-hexan (3.4) trong 3 min, sử dụng lớp phía dưới.

3.6. Diclometan1).

3.7. Metanol.

3.8. Dung dịch natri clorua, bão hòa.

3.9. Dung dịch natri hydroxit, c = 0,05 mol/l.

CHÚ THÍCH: Dung dịch natri hydroxit có thể là nguồn gốc gây nhiễm bẩn. Các sản phẩm thích hợp ví dụ: Thuốc thử thủy phân để phân tích thuốc bảo vệ thực vật carbamat CB 1302) hoặc dung dịch natri hydroxit (1 mol/l) đối với HPCE, Merck số 1022513).

3.10. Chất trợ lọc, ví dụ Celite 545®4)

3.11. Vật liệu nhồi rắn, Extralut NT²⁾ nhồi lại.

3.12. o-Phthaldialaldehyd

3.13. Dung dịch đệm tetraborat, 38,1 g/l tetraborat ngậm mười phân tử nước trong nước.

3.14. 2-Mercaptoetanol.

3.15. Pha động A

Nước được tinh sạch bằng hệ thống tinh sạch nước loại LC. Trước khi sử dụng, lọc bằng cách hút nhẹ qua bộ lọc màng (4.13).

3.16. Pha động B

Axetonitril (3.). Trước khi sử dụng, lọc bằng cách hút nhẹ qua bộ lọc màng (4.13).

3.17. Thuốc thử OPA

Hòa tan 1 g o-phthaldialdehyd (3.12) trong khoảng 10 ml metanol (3.7) đựng trong bình định mức 1000 ml và thêm 0,4 ml 2-mercaptoetanol (3.14), pha loãng đến vạch bằng dung dịch đệm tetraborat (3.13). Chỉnh pH của dung dịch đến 10. Bảo quản dung dịch trong môi trường nitơ.

CHÚ THÍCH: Cách khác, có thể sử dụng “Thuốc thử dẫn xuất 2”.

3.18. Vật liệu chuẩn

Các loại thuốc bảo vệ thực vật N-metylcarbamat như aldicarb, bendiocarb, bufencarb, butocarboxim, carbaryl, carbofuran, dioxacarb, ethiofencarb, furathiocarb, methiocarb, methomyl, oxamyl, promecarb, propoxur, thiocarb, thiofanox, trimethacarb, các chất chuyển hóa 3-hydroxy-carbofuran và 3-keto-carbofuran và sulfoxide và các chất chuyển hóa sulfon của aldicarb, butocarboxim và thiofanox.

3.19. Các dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật, r = 2,0 mg/ml

Hòa tan 50 mg vật liệu chuẩn (3.18) trong axetonitril (3.3) trong bình định mức 25 ml và thêm axetonitril cho đến vạch.

3.20. Dung dịch chuẩn thuốc bảo vệ thực vật

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn thích hợp bằng cách pha loãng các lượng thích hợp của các dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật (3.19) với metanol, ví dụ: đến 1 mg/ml hoặc 0,1 mg/ml, nếu cần.

4. Thiết bị và dụng cụ

4.1. Yêu cầu chung

Tất cả các dụng cụ thủy tinh được sử dụng phải được rửa kỹ. Có thể sử dụng dung dịch tẩy rửa nóng, nhưng sau đó phải được tráng kỹ bằng nước cất và axeton trước khi làm khô.

Sử dụng thiết bị và dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường, cụ thể như sau:

4.2. Máy thái thực phẩm dạng nhỏ.

4.3. Bộ đồng hóa hoặc bộ trộn tốc độ cao.

4.4. Chai thủy tinh, 500 ml.

4.5. Bộ cô quay, có nồi cách thủy, có thể duy trì được ở 35 ^oC.

4.6. Phễu sứ Buchner, đường kính 9,5 cm.

4.7. Bình lọc, 1 l.

4.8. Bộ lọc sợi thủy tinh, đường kính 9 cm.

4.9. Phễu chiết, 1 l.

4.10. Cột được nhồi bằng diatomit, có thể dùng cho thể tích dung dịch 20 ml, ví dụ: cột polypropylen được nhồi trước Extrelut NT 20²⁾, Chem Elut 20 ml5) hoặc Chromabond XTR (70 ml)6). Các cột Extrelut NT 20 được sử dụng có thể được nhồi đầy lại bằng vật liệu nhồi lại Extrelut NT (3.11).

4.11. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, được trang bị:

4.11.1. Hệ thống bơm kép có van bơm sáu cổng với vòng lấy mẫu 20 ml, detector huỳnh quang và bộ phận định lượng có hệ thống tích phân.

4.11.2. Cột phân tích HPLC, cột bằng thép không gỉ, dài 250 mm, đường kính trong 4,0 mm (ví dụ: được nhồi bằng RP Select B (cỡ hạt 5 mm).

4.11.3. Hệ thống sau cột, gồm có hai cuộn phản ứng trong các bộ ổn nhiệt khác nhau, các chi tiết chữ T thể tích chết thấp và hai bơm thuốc thử không xung.

CHÚ THÍCH: Hệ thống LC sau cột hoàn chỉnh để phân tích N-metylcarbamat có bán sẵn trên thị trường.

4.12. Thiết bị siêu âm.

4.13. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 mm.

5. Lấy mẫu

Chuẩn bị mẫu phòng thử nghiệm theo phương pháp khuyến cáo chung cho việc lấy mẫu để thu được mẫu đại diện của sản phẩm cần phân tích.

6. Chuẩn bị mẫu thử

Khi có thể, tiến hành phân tích mẫu ngay khi được chuyển đến phòng thử nghiệm. Không phân tích mẫu phòng thử nghiệm khi mẫu đã bị hỏng.

Để phân tích, chỉ lấy phần mẫu phòng thử nghiệm áp dụng giới hạn dư lượng tối đa. Có thể không phải loại bỏ tiếp các phần của thực vật. Ghi lại các phần của thực vật đã loại bỏ. Mẫu đã chuẩn bị này là mẫu thử.

Nếu mẫu không thể phân tích ngay thì bảo quản ở 0 ^oC đến 5 ^oC không quá 3 ngày trước khi phân tích.

Tiến hành giảm mẫu phòng thử nghiệm theo cách sao cho thu được các phần đại diện (ví dụ: được chia bốn và chọn hai phần đối diện). Khi các mẫu thử là những đơn vị nhỏ (ví dụ như quả nhỏ, đậu đỗ, ngũ cốc) thì mẫu thử phải được trộn đều trước khi cân để lấy phần mẫu thử. Khi mẫu thử là các đơn vị lớn, thì lấy các phần hình chữ V (ví dụ: rau và quả lớn) hoặc các lát cắt ngang (ví dụ: dưa chuột) gồm cả lớp ngoài của từng đơn vị.

Từ mỗi mẫu thử, lấy ra các phần có thể gây nhiễu đến qui trình phân tích. Trong trường hợp đối với quả có hạt thì loại bỏ hạt. Chú ý sao cho không loại bỏ phần thịt quả. Cơ sở để tính dư lượng là khối lượng ban đầu của mẫu thử ban đầu (cả hạt).

Nếu mẫu cần phải bảo quản quá 3 ngày thì mẫu phải được làm đông lạnh ở âm 18 ^oC hoặc thấp hơn. Để đảm bảo rằng ngay cả sau khi được rã đông có thể lấy được mẫu đại diện, thì chuẩn bị các phần của sản phẩm đủ cho một lần phân tích.

Cắt mẫu thử và cân các phần mẫu thử 50 g chính xác đến ± 1%.

7. Cách tiến hành

7.1. Yêu cầu chung

Chuẩn bị mẫu trắng thuốc thử và các mẫu trắng chất nền và thực hiện các phép thử thu hồi thích hợp với các giới hạn dư lượng tối đa.

CHÚ THÍCH: Người phân tích phải hiểu rõ về phương pháp trước khi bắt đầu phân tích.

7.2. Tách chiết (trừ quả cam chanh)

Đồng hóa 50 g (m) mẫu thử với 250 ml diclometan (3.6) 3 min trong chai thủy tinh (4.4), thêm 10 g đến 15 g chất trợ lọc (3.10). Lọc dịch đã đồng hóa bằng cách hút qua bộ lọc sợi thủy tinh (4.8) trong phễu Buchner (4.6), sử dụng 100 ml diclometan để tráng chai thủy tinh và cặn lọc. Chuyển dịch lọc sang bình cầu đáy tròn 500 ml và cho bay hơi diclometan trên bộ cất quay (4.5) để thu được phần cặn. Pha loãng lượng cặn bằng dung dịch natri clorua (3.8) để có được tổng thể tích 20 ml và để bình trong thiết bị siêu âm (4.12) trong 1 min.

7.3. Tách chiết (đối với quả cam chanh)

Đồng hóa 50 g (m) mẫu thử với 300 ml axetonitril bão hòa n-hexan (3.5) 3 min trong chai thủy tinh (4.4), thêm 10 g đến 15 g chất trợ lọc (3.10). Lọc dịch đã đồng hóa bằng cách hút qua bộ lọc sợi thủy tinh (4.8) trong phễu Buchner (4.6), sử dụng 100 ml axetonitril bão hòa n-hexan để tráng chai thủy tinh và cặn lọc. Chuyển dịch lọc sang phễu chiết (4.9), lắc và bổ sung n-hexan (3.4) hai lần, mỗi lần 150 ml. Loại bỏ lớp hexan phía trên. Chuyển pha axetonitril sang bình cầu đáy tròn 500 ml và cho bay hơi trên bộ cất quay (4.5) chỉ đến vừa khô.

Hòa tan cặn trong 20 ml dung dịch natri clorua (3.8) và để yên bình cầu trong thiết bị siêu âm (4.12) trong 1 min.

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ nồi cách thủy của bộ cô quay không được vượt quá 35 ^oC. Sử dụng iso-octan làm chất hãm để tránh thất thoát.

7.4. Làm sạch

Chuyển dung dịch thu được trong 7.2 hoặc 7.3 sang cột nhồi diatomit (4.10) và đảm bảo rằng phần dưới của cột nhồi (khoảng 20 %) vẫn khô. Để yên cột 15 min. Rửa giải cột bốn lần, mỗi lần dùng 25 ml diclometan (3.6), tráng rửa bình cầu đáy tròn bằng hai phần dịch đầu tiên. Thu lấy dịch rửa giải vào bình cầu đáy tròn 250 ml và cho bay hơi dung dịch trong bộ cất quay chỉ đến vừa khô. Hòa tan cặn trong 3 ml đến 4 ml metanol (3.7), chuyển dung dịch sang bình định mức 5 ml và thêm metanol đến vạch (V_end = 5 ml).

7.5. Đo HPLC

Lọc dung dịch thu được trong 7.4 qua bộ lọc màng (4.13) và bơm 20 ml (V_i) lên hệ thống HPLC (4.11) dùng cột phân tích như ví dụ trong 4.11.2.

Áp dụng chương trình gradient hai yếu tố sau đây, ở tốc độ dòng 1,0 ml/min và nhiệt độ cột 40^oC: 85% pha động A và 15% pha động B trong 10 min, sau đó áp dụng tuyến tính từ 15% đến 80% pha động B trong suốt 50 min, cuối cùng 80% pha động B trong 30 min.

Để rửa giải cột phân tích HPLC, cho dung dịch natri hydroxit (3.9) với tốc độ 0,3 ml/min qua cuộn phản ứng 0,5 ml được duy trì ở 100 ^oC.

Để rửa giải cuộn thứ nhất, cho thuốc thử OPA (3.17) với tốc độ 0,3 ml/min vào cuộn phản ứng 0,5 ml được duy trì ở 20 ^oC.

Cho hỗn hợp đi quan detector huỳnh quang. Các bước sóng kích thích và phát xạ được cài đặt tương ứng 330 nm và 465 nm.

CHÚ THÍCH: Cách khác có thể sử dụng các điều kiện vận hành HPLC khác, nếu cho kết quả tương tự.

8. Tính kết quả

Để nhận biết sự có mặt của N-metylcarbamat, thì so sánh thời gian lưu của các pic thu được đối với dung dịch mẫu thử thu được bằng cách trộn và pha loãng dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật (3.19) thích hợp.

CHÚ THÍCH: Kết quả dương tính đối với carbofuran có thể do dư lượng carbosulfan.

Để định lượng N-metylcarbamat đã nhận dạng, sử dụng các dung dịch chuẩn (3.20) của hợp chất này có các nồng độ thích hợp, ví dụ: từ 0,005 mg/ml đến 0,05 mg/ml. Tiến hành theo 7.5. Trong sắc ký đồ, đo chiều cao pic (hoặc diện tích pic) của hợp chất trong dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn.

Tính phần khối lượng, w, bằng miligam trên kilogam mẫu thử, theo công thức (1):

       (1)

Trong đó:

A là chiều cao pic hoặc diện tích pic thu được từ dung dịch mẫu thử;

A_St là chiều cao pic hoặc diện tích pic thu được từ dung dịch chuẩn;

V_end là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử thu được trong 7.4, tính bằng mililit (ml);

V₁ là thể tích phần bơm V_end vào HPLC, tính bằng microlit (ml);

m_st là khối lượng hợp chất nhận dạng được trong dung dịch chuẩn, được bơm vào HPLC, tính bằng nanogam (ng);

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

9. Phép thử khẳng định

Cần tiến hành các phép thử khẳng định việc nhận dạng và định lượng các dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quan sát được, đặc biệt là trong các trường hợp cho thấy vượt quá các mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL).

Phương pháp cặp đôi sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp điển hình để khẳng định việc nhận dạng và định lượng N-metylcarbamat. Đối với các hợp chất này mà không phân tích được bằng sắc ký khí, thì các kỹ thuật sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng detector chuỗi diot quang (LC-DAD) là thích hợp.

10. Độ chụm, độ lặp lại và độ tái lập

Các chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm quốc tế về độ chụm của phương pháp theo ISO 5725 được nêu trong Bảng 1 và Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử này có thể không áp dụng được cho dãy nồng độ và chất nền khác với các giá trị nêu trong Phụ lục A.

Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được của hai lần thử nghiệm riêng rẽ, khi sử dụng cùng một phương pháp, phân tích trên cùng nguyên liệu, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, dùng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn không lớn hơn 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại, r.

Chênh lệch tuyệt đối giữa kết quả thu được của hai lần thử nghiệm riêng rẽ, trên vật liệu thử giống hệt nhau do hai phòng thử nghiệm thực hiện không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập, R.

Bảng 1 – Dữ liệu về độ chụm

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- Viện dẫn tiêu chuẩn này;

- Kết quả thu được và đơn vị tính;

- Ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

- Ngày nhận mẫu;

- Ngày thử nghiệm;

- Mọi điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- Mọi chi tiết thao tác không được quy định trong phương pháp này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các thông số sau đây thu được từ nghiên cứu liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725. Các phép thử này do tám phòng thử nghiệm tham gia thực hiện với sự hướng dẫn của Nhóm Phân tích Dư lượng của Viện nghiên cứu Bảo vệ người tiêu dùng và Thuốc thú y của Liên bang Đức [3].

A.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với Aldicarb và Aldicarb sulfoxide

Bảng A.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với Furathiocarb và Thiodicarb

Bảng A.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với Aldicarb sulfon (Aldoxycarb), Carbofuran và 3-OH-Carbofuran

Bảng A.4 – Dữ liệu về độ chụm đối với Methomyl, Oxamyl và Propoxur

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Krause. R. T.: Liquid chromatographic determination of N-methylcarbamate insecticides and metabolites in crops. I. Collaborative study, J.Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 726-733 (1985).

[2] Blass, W., Philipowski, C: Bestimmimg von N-Methylcarbamat-Ruckstanden mil HPLC und on-line gekoppeltem Reaktionsdeteklor in Lebensmitteln pflanzlicher Herkunft und Boden, PRanzenschutz-Nachr. Bayer 45, 277-318 (1992).

[3] Food analysis – High performance liquid chromatographic method for the determination of N-methylcarbamate residues in fruit and vegetables (Untersuchung von Lebensmitteln – Hochdruck – flQssigchromatographische Bestimmung von N-Methycarbamat-ROckstanden in Obst und Gemiise). L29.00-6 in: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Office of Consumer Protection and Food Safety (Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LM0G: Vergfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgengenstanden/Bundesamt fur Verbraucherschutz und Lebensmittel-sicherheit) Loose leaf edition. {Loseblattausgabe), 2004, Berlin, K6ln: Beuth Verlag GmbH

[4] ISO 1750, Pesticides and other agrochemicals – Common names.

[5] TCVN 6910 Phần 1 đến 6 (ISO 5725, part 1 to 6) – Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo.