TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8375:2010

THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN –

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG METYLTESTOSTERON VÀ DIETYLSTILBESTROL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ - KHỐI PHỔ (LC-MS/MS)

Fish and fishery products –

Determination of methyltestosteron and diethylstibestrol content by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

Lời nói đầu

TCVN 8375 : 2010 do Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng metyltestosteron [(17β)-17-hydroxy-17-methylandrost-4-ene-3-one] và dietylstilbestrol [4,4'-(3E)-hex-3-ene-3,4-diyldiphenol] trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ - khối phổ (LC-MS/MS).

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 µg/kg. Giới hạn định lượng là 1,5 µg/kg.

2. Nguyên tắc

Mẫu được thủy phân với subtilin để giải phóng metyltestosteron và dietylstilbestrol. Metyltestosteron và dietylstilbestrol tự do được chiết tách khỏi mẫu bằng tert-butyl metyl ete. Dịch chiết được loại chất béo bằng quá trình chiết lỏng-lỏng với n-hexan và sau đó làm sạch bằng cách chiết pha rắn. Hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol trong dịch giải hấp được xác định bằng LC-MS/MS.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC, trừ khi có quy định khác.

3.1 Chuẩn metyltestosteron, đã biết độ tinh khiết.

3.2 Chuẩn metyltestosteron-d₃, đã biết độ tinh khiết.

3.3 Chuẩn dietylstilbestrol, đã biết độ tinh khiết.

3.4 Metanol.

3.5 n-Hexan.

3.6 Axeton.

3.7 Tert-butyl metyl ete (TBME).

3.8 Proteaza subtilisin, Sigma-Aldrich, Đức hoặc tương đương.

3.9 Tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris).

3.10 Dung dịch amoniac 25 %.

3.11 Dung dịch chuẩn gốc metyltestosteron (SM0), nồng độ 1 000 mg/l.

Cân chính xác 100 mg ± 0,1 mg chuẩn metyltestosteron trên cân phân tích. Thêm khoảng 80 ml metanol, đặt vào bể siêu âm đến khi metyltestosteron hoà tan hoàn toàn, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml. Thêm metanol đến vạch mức. Đậy chặt nắp, trộn đều.

Dung dịch này bền trong 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.12 Dung dịch chuẩn gốc dietylstilbestrol (SD0), nồng độ 1 000 mg/l

Cân chính xác 100 mg ± 0,1 mg chuẩn dietylstilbestrol trên cân phân tích. Thêm khoảng 80 ml metanol, đặt vào bể siêu âm đến khi dietylstilbestrol hoà tan hoàn toàn, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml. Thêm metanol đến vạch mức. Đậy chặt nắp, trộn đều.

Dung dịch này bền trong 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.13 Dung dịch chuẩn hỗn hợp metyltestosteron và dietylstilbestrol (SMD1), nồng độ 10 mg/l

Pha loãng chính xác 0,1 ml dung dịch chuẩn gốc SM0 (3.11) và 0,1 ml dung dịch chuẩn gốc SD0 (3.12) với metanol và định mức đến 10 ml. Đậy chặt nắp, trộn đều.

Dung dịch này bền trong 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.14 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc metyltestosteron và dietylstilbestrol (SMD2), nồng độ 100 µg/l

Pha loãng chính xác 0,1 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp SMD1 (3.13) với metanol và định mức đến 10 ml.

Dung dịch này bền trong 1 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.15 Dung dịch nội chuẩn gốc metyltestosteron-d₃ (ISM0), nồng độ 1 000 mg/l

Cân chính xác 100 mg ± 0,1 mg chuẩn metyltestosteron-d₃ trên cân phân tích. Thêm khoảng 80 ml metanol, đặt vào bể siêu âm đến khi metyltestosteron-d₃ hoà tan hoàn toàn, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml. Thêm metanol đến vạch mức. Đậy chặt nắp, trộn đều.

Dung dịch này bền trong 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.16 Dung dịch nội chuẩn gốc dietylstilbestrol-d₆ (ISD0), nồng độ 1 000 mg/l

Cân chính xác 100 mg ± 0,1 mg chuẩn dietylstilbestrol-d₆ trên cân phân tích. Thêm khoảng 80 ml metanol, đặt vào bể siêu âm đến khi dietylstilbestrol-d₆ hoà tan hoàn toàn, chuyển dung dịch vào bình định mức 100 ml. Thêm metanol đến vạch mức. Đậy chặt nắp, trộn đều.

Dung dịch này bền trong 1 năm khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.17 Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp metyltestosteron-d₃ và dietylstilbestrol-d₆ (ISMD1), nồng độ 10 mg/l

Pha loãng chính xác 0,1 ml dung dịch chuẩn gốc ISM0 (3.15) và 0,1 ml dung dịch chuẩn gốc ISD0 (3.16) với metanol và định mức đến 10 ml. Đậy chặt nắp, trộn đều.

Dung dịch này bền trong 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.18 Dung dịch nội chuẩn hỗn hợp làm việc metyltestosteron-d₃ và dietylstilbestrol-d₆ (ISMD2), nồng độ 100 µg/l

Pha loãng chính xác 0,1 ml dung dịch nội chuẩn ISMD1 (3.17) với metanol và định mức đến 10ml.

Dung dịch này bền trong 1 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ –20 ^oC.

3.19 Dung dịch đệm Tris 0,1 M (pH 9,5)

Hòa tan 12,1 g Tris (3.9) trong 1 000 ml nước.

3.20 Dung dịch 2 % amoniac trong nước

Pha loãng 8 ml dung dịch amoniac 25 % (3.10) bằng 92 ml nước.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Máy ly tâm, tốc độ 3 000 r/min.

4.2 Máy lắc vortex.

4.3 Bộ thổi khí nitơ làm khô.

4.4 Bể điều nhiệt.

4.5 Tủ ủ, có thể hoạt động ở 55 ⁰C.

4.6 Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

4.7 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.

4.8 Hệ thống LC - MS/MS

Hệ thống sắc ký lỏng gồm lò cột, bơm và hệ thống tiêm mẫu

– cột sắc ký pha đảo C18 dài 150 mm, đường kính trong 2,0 mm, kích thước hạt 5 µm (hoặc tương đương) có cột bảo vệ C18 dài 20 mm, đường kính trong 2,0 mm, kích thước hạt 5 µm.

– đầu dò khối phổ dạng tứ cực kép với nguồn ion hóa ESI.

4.9 Máy lắc ngang.

4.10 Cột chiết pha rắn SPE Oasis HLB (60 mg, 3 ml).

4.11 Cột chiết pha rắn SPE Amino Supelco NH2 (500 mg, 3 ml).

4.12 Micropipet, dung tích 100 µl, 1 000 µl và 5 ml.

4.13 Ống ly tâm nhựa có nắp, dung tích 15 ml và 50 ml.

4.14 Màng lọc PTFE, kích thước 0,2 µm

5. Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu

5.1.1 Xử lý mẫu

Tách thịt từ những vị trí khác nhau của mẫu. Cắt phần mẫu vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ 3 cm đến 5 cm. Cho phần mẫu vừa cắt (khoảng 100 g) vào máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất.

5.1.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Cân 5,0 g mẫu thủy sản trắng (không chứa metyltestosteron và dietylstilbestrol) vào ống nghiệm nhựa 50 ml có nắp. Thêm chính xác 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn ISMD2 (hàm lượng nội chuẩn trong mẫu là 2 µg/l), để yên 30 min.

5.1.3 Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn để xây dựng đường chuẩn (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2 μg/kg)

Cân lần lượt 5,0 g mẫu thủy sản trắng vào 5 ống ly tâm 50 ml.

Thêm chính xác các dung dịch chuẩn và nội chuẩn nội theo quy định trong Bảng 1 và để yên trong 30 min.

Tiến hành chuẩn bị mẫu thêm chuẩn giống như chuẩn bị với mẫu thử theo quy định tại 5.1.

Bảng 1 – Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn để xây dựng đường chuẩn

5.1.4 Chuẩn bị mẫu thử

Cân 5,0 g mẫu thử đã nghiền vào ống nghiệm nhựa 50 ml có nắp. Thêm chính xác 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn ISMD2 (hàm lượng nội chuẩn trong mẫu là 2 µg/l), để yên 30 min.

5.2 Xác định

5.2.1 Chiết tách metyltestosteron và dietylstilbestrol từ mẫu

Thêm 15 ml dung dịch đệm Tris 0,1 M (pH 9,5) chứa 5 mg subtilisin vào các ống nghiệm đã chuẩn bị ở 5.1.2, 5.1.3, 5.1.4. Lắc và trộn đều trong 2 min bằng máy lắc (vortex). Ủ hỗn hợp trong 2 h ở 52 ⁰C trong tủ ủ. Sau đó làm lạnh hỗn hợp đến nhiệt độ phòng.

Thêm 10 ml TBME. Lắc và trộn đều trong 10 min bằng máy lắc. Ly tâm mẫu với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Dùng pipet hút lớp TBME sang ống nghiệm 50 ml mới. Thêm 10 ml TBME vào cặn mẫu. Lắc và trộn đều trong 10 min bằng máy lắc. Ly tâm mẫu với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Dùng pipet hút lớp TBME sang cùng ống nghiệm 50 ml chứa TBME trước đó. Thổi khô dung dịch TBME trong ống nghiệm dưới dòng khí nitơ ở 55 ⁰C.

Thêm 4 ml hỗn hợp metanol : nước (tỷ lệ 4 : 1 theo thể tích) vào ống nghiệm, lắc đều.

Thêm 6 ml hexan. Lắc mạnh trong 30 s. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min. Loại bỏ lớp hexan.

Thêm 4 ml hexan. Lắc mạnh trong 30 s. Ly tâm trong 5 min với tốc độ 3 000 r/min. Loại bỏ lớp hexan.

Cô dung dịch trong ống nghiệm dưới dòng khí nitơ ở 55 ^oC đến khi còn khoảng 0,5 ml. Thêm 3 ml hỗn hợp metanol : nước (tỷ lệ 1 : 9 theo thể tích). Lắc đều.

5.2.2 Làm sạch dịch mẫu bằng cột chiết pha rắn Oasis HLB và cột Amimo

Hoạt hóa cột Oasis HLB bằng 3 ml metanol và 3 ml nước. Hoạt hóa cột amino bằng 3 ml hỗn hợp axeton : metanol (tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích).

Cho dung dịch mẫu qua cột Oasis HLB đã hoạt hóa. Rửa cột 3 lần, lần 1 dùng 3 ml metanol 5 % trong hỗn hợp ammoni 2 % trong nước (theo thể tích), lần 2 dùng 3 ml metanol 40 % trong hỗn hợp ammoni 2 % trong nước (theo thể tích), lần 3 dùng 3 ml nước. Giải hấp bằng 3 ml dung dịch giải hấp (hỗn hợp axeton : metanol, tỷ lệ 80 : 20 theo thể tích).

Cho dịch giải hấp ở bước trên vào cột amino đã hoạt hóa, hứng trực tiếp dịch qua cột vào ống nghiệm 15 ml. Thổi khô dung dịch qua cột đến khô dưới dòng khí nitơ ở 55 ^oC. Hoà tan cặn khô bằng 0,6 ml metanol, lắc bằng máy lắc trong 20 s. Lọc qua màng lọc 0,2 µm.

Tiêm 20 µl dung dịch vào hệ thống LC-MS/MS.

5.3 Thông số cài đặt thiết bị

5.3.1 Thông số cài đặt cho LC

– Pha động A: nước HPLC

– Pha động B: metanol HPLC

– Thành phần pha động thay đổi theo thời gian (chế độ gradient) được mô tả ở Bảng 2.

Bảng 2 – Thành phần pha động theo thời gian

– thể tích tiêm: 20 µl

– tốc độ dòng: 0,7 ml/min

– thời gian phân tích: 28 min

– nhiệt độ cột: 35 ^oC

5.3.2 Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ

Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ để xác định metyltestosteron

– nguồn ion hóa: ESI (+)

– điện thế mao quản: 1 kV

– điện thế bộ tách chiết: 2,0 V

– điện thế RF: 0,0 V

– nhiệt độ nguồn: 120 ^oC

– nhiệt độ khử dung môi: 400 ^oC

– tốc độ khí khử dung môi: 460 l/h

– bộ phân tích

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0

+ năng lượng ion hoá 1: 0,5 eV

+ điện thế cửa vào: –1 V

+ điện thế cửa ra: 1 V

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0

+ năng lượng ion hoá 2 : 3

+ điện thế bộ khuếch đại: 650 V

+ áp suất chân không: 4,5 x 10^-3 mbar

+ chế độ vận hành: chuẩn

Thông số cài đặt cho đầu dò khối phổ-khối phổ để xác định dietylstilbestrol

– nguồn ion hóa: ESI (-)

– điện thế mao quản: 2 kV

– điện thế bộ tách chiết: 2,0 V

– điện thế RF: 0,0 V

– nhiệt độ nguồn: 120 ^oC

– nhiệt độ khử dung môi: 400 ^oC

– tốc độ khí khử dung môi: 460 l/h

– bộ phân tích

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM1: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM1: 15,0

+ năng lượng ion hoá 1: 1 eV

+ điện thế cửa vào: –1 V

+ điện thế cửa ra: 1 V

+ độ phân giải vùng khối lượng thấp LM2: 15,0

+ độ phân giải vùng khối lượng cao HM2: 15,0

+ năng lượng ion hoá 2: 1,5

+ điện thế bộ khuếch đại: 650 V

+ áp suất chân không: 4,5 x 10^-3 mbar

+ chế độ vận hành: chuẩn

– các điều kiện phân ly MS/MS:

Bảng 3 – Các điều kiện phân ly MS/MS

5.3.3 Thứ tự tiêm mẫu

– tiêm các dịch mẫu xây dựng đường chuẩn.

– tiêm dịch mẫu trắng.

– tiêm các dịch mẫu thử nghiệm. Tính hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol trong mẫu thử nghiệm.

5.4 Dựng đường chuẩn

Xây dựng đồ thị hệ số tín hiệu RF của dịch mẫu xây dựng đường chuẩn (trục tung) với nồng độ chất chuẩn metyltestosteron/ dietylstilbestrol bổ sung (trục hoành) theo phương pháp hồi quy tuyến tính:

RF = ax + b

Trong đó:

b          là tung độ góc của đường chuẩn;

a          là hệ số góc của đường chuẩn;

x          là nồng độ chất chuẩn metyltestosteron bổ sung trong mẫu (µg/kg);

RF        là hệ số tín hiệu, được tính theo:

Trong đó:

Sp        là diện tích píc của ion thứ cấp có cường độ cao của metyltestosteron (303 > 96,5)/ dietylstilbestrol (267,2 > 237,0);

Sp_IS             là diện tích píc của ion thứ cấp của metyltestosteron-d₃ (306 > 96,5)/ dietylstilbestrol-d₆ (273,2 > 225,5).

6 Tính kết quả

Hàm lượng metyltestosteron và dietylstilbestrol có trong mẫu, C, được biểu thị bằng microgam trên kilogam (µg/kg) theo công thức sau:

C = (RF – b) / a

Trong đó:

RF            là hệ số tín hiệu của mẫu thử;

a, b           xem 5.4.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng đến kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU

A.1 Các sắc ký đồ tiêu biểu trong xác định metyltestosteron

A.1.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng

Metyltestosteron-d₃: thời gian lưu 11,86 min, 306 > 96,5

Metyltestosteron: thời gian lưu 11,86 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5

A.1.2 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm metyltestosteron tại nồng độ 2,5 µg/kg

Metyltestosteron-d₃: thời gian lưu 11,88 min, 306 > 96,5

Metyltestosteron: thời gian lưu 11,90 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5

A.1.3 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm metyltestosteron tại giới hạn phát hiện (0,5 µg/kg)

Metyltestosteron-d₃: thời gian lưu 11,78 min, 306 > 96,5

Metyltestosteron: thời gian lưu 11,81 min, 303 > 108,6, 303 > 96,5

A.2 Các sắc ký đồ tiêu biểu trong xác định dietylstilbestrol

A.2.1 Sắc ký đồ của mẫu trắng

A.2.2 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm dietylstilbestrol tại nồng độ 2,5 µg/kg

A.2.3 Sắc ký đồ của mẫu gây nhiễm dietylstilbestrol tại giới hạn phát hiện (0,5 µg/kg)

Dietylstilbestrol: thời gian lưu 8,90 min, 267,2 > 237, 267,2 > 222,5

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

B.1 Dữ liệu về độ chụm của phương pháp xác định metytestosteron

B.2 Dữ liệu về độ chụm của phương pháp xác định metytestosteron

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] George Kaklamanos, Georgios Theodoridis, Themistoklis Dabalis, Journal of Chromatography A, (2009)

[2] A. Onal, Food Chem. 103 (2007) 1475

[3] N. Innocente, M. Biasutti, M. Padovese, S. Moret, Food Chem. 101 (2007) 1285

[4] G. mo Dugo, F. Vilasi, G.L. La Torre, T.M. Pellicano, Food Chem. 95 (2006) 672

[5] Y.I. Yashin, A.Y. Yashin, J. Anal. Chem. 59 (2004) 1121

[6] A.L. Cinquina, A. Cali, F. Longoa, L. De Santis, A. Severoni, F. Abballe, J. Chromatogr. A 1032 (2004) 73

[7] S. Cortacero-Ramırez, D. Arraez-Roman, A. Segura-Carreteo, A. Fernandez-Gutierrez, Food Chem. 100 (2007) 383

[8] P. Pastore, G. Favaro, D. Badocco, A. Tapparo, S. Cavalli, J. Chromatogr. A 1098 (2005) 111

[9] G. Saccani, E. Tanzi, P. Pastore, S. Cavalli, M. Rey, J. Chromatogr. A 1082 (2005) 43

[10] F. Calbiani, M. Careri, L. Eviri, A. Mangia, L. Ristara, I. Zagnoni, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 3779

[11] F. Gosetti, E. Mazzucco, V. Gianotti, S. Polati, M.C. Gennaro, J. Chromatogr A 1149 (2007) 151.