TCVN 11925:2017 ISO 20837:2006 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm-Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11925:2017
ISO 20837:2006

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - YÊU CẦU VỀ CHUẨN BỊ MẪU ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỊNH TÍNH

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection

Lời nói đầu

TCVN 11925:2017 hoàn toàn tương đương với ISO 20837:2006;

TCVN 11925:2017 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm bằng phương pháp PCR thường được thực hiện bằng các bước liên tiếp (hoặc đồng thời) sau đây:

- đồng hóa mẫu;

- (nuôi cấy) tăng sinh vi sinh vật gây bệnh cần tìm và xử lý mẫu;

- tách chiết axit nucleic (tùy chọn);

- khuếch đại axit nucleic của vi sinh vật gây bệnh cần tìm;

- phát hiện ADN được khuếch đại của vi sinh vật gây bệnh cần tìm.

Tham khảo các tiêu chuẩn liên quan đến việc tăng sinh vi khuẩn từ các nền mẫu thực phẩm được nêu trong Phụ lục A. Ví dụ về phương pháp chuẩn bị mẫu cụ thể được nêu trong Phụ lục B.

Tiêu chuẩn này có liên quan đến nhóm tiêu chuẩn dưới tiêu đề chung Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm:

- TCVN 7682 (ISO 20838) Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính

- TCVN 11131 (ISO/TS 20836) Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt

- TCVN 11134 (ISO 22174) Định nghĩa và yêu cầu chung

- TCVN 11925 (ISO 20837) Yêu cầu về chuẩn bị mẫu để phát hiện định tính.

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - YÊU CẦU VỀ CHUẨN BỊ MẪU ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỊNH TÍNH

Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng hoặc các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này cung cấp các tiêu chí và các ví dụ về việc chuẩn bị mẫu để thu được các mẫu PCR- tương thích hoặc các axit nucleic có chất lượng và số lượng phù hợp với phản ứng PCR.

Tiêu chuẩn này mô tả các nguyên tắc chung có liên quan. Tham khảo các tiêu chuẩn có liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật được nêu trong Phụ lục A và phương pháp tách chiết ADN cụ thể được nêu trong Phụ lục B.

Tiêu chuẩn này được thiết lập cho các nền mẫu thực phẩm, nhưng cũng có thể áp dụng được cho các nền mẫu thức ăn chăn nuôi và sản phẩm nông nghiệp/mẫu môi trường với một số điều chỉnh, nếu cần.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa và yêu cầu chung

3  Nguyên tắc

3.1  Yêu cầu chung

Mục tiêu của các phương pháp chuẩn bị mẫu là để thu được các mẫu hoặc các axit nucleic có chất lượng và số lượng phù hợp với phản ứng PCR.

CHÚ THÍCH: Chất lượng của các axit nucleic phụ thuộc vào ví dụ độ tinh khiết hóa học, độ dài trung bình của các phân tử và tính toàn vẹn cấu trúc của các phân tử axit nucleic tách chiết được.

Việc tăng sinh và xử lý mẫu có thể cho phép phát hiện số lượng thấp các vi sinh vật đích và giảm các chất ức chế phản ứng PCR. Các quy trình vật lý, hóa học hoặc sinh hóa ít gây hại nhất đến tính toàn vẹn của axit nucleic, làm cho mẫu hoặc dung dịch axit nucleic tương thích với phản ứng khuếch đại PCR.

3.2  Tăng sinh và xử lý mẫu

Việc xử lý mẫu có thể bắt đầu trực tiếp từ mẫu hoặc sau khi mẫu đã được tăng sinh như trong các tiêu chuẩn được liệt kê ở Phụ lục A hoặc tiêu chuẩn thích hợp khác.

3.3  Tách chiết axit nucleic

Các nguyên tắc cơ bản của việc tách chiết axit nucleic bao gồm việc giải phóng ADN của vi khuẩn và loại bỏ đồng thời hoặc tiếp theo các chất ức chế phản ứng PCR.

Ví dụ về phương pháp tách chiết/tinh sạch ADN được nêu trong Phụ lục B. Phương pháp này chỉ là một ví dụ và cần được người sử dụng điều chỉnh cho phù hợp với mục đích của từng phòng thử nghiệm.

4  Yêu cầu chung của phòng thử nghiệm

Thực hiện xử lý mẫu tại các phòng/khu vực riêng theo quy định trong 6.3 của TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

5  Thuốc thử, thiết bị và dụng cụ

Xem Phụ lục A và Phụ lục B của tiêu chuẩn này và xem thêm TCVN 11134 (ISO 22174).

6  Cách tiến hành

6.1  Tăng sinh và xử lý mẫu vi khuẩn

Các mẫu thực phẩm phải được tăng sinh theo các tiêu chuẩn tương ứng hoặc các tiêu chuẩn thích hợp khác. Có thể sử dụng môi trường tăng sinh khác thích hợp hơn với PCR, nếu sử dụng, các môi trường này cần được đánh giá xác nhận, để có hiệu năng ít nhất là tương đương với hiệu năng của môi trường quy định trong các tiêu chuẩn cụ thể.

Một số môi trường tăng sinh được khuyến cáo trong các tiêu chuẩn có chứa ít chất ức chế-phản ứng PCR hơn so với môi trường khác, nên cần được xem xét cẩn thận khi chọn phương pháp chuẩn bị mẫu.

Đối với một số sản phẩm, cần đặc biệt chú ý để ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh (ví dụ bằng cách bổ sung hóa chất hoặc kháng sinh chọn lọc).

Các phương pháp ít gây hại nhất, ví dụ như pha loãng, ly tâm, phân hủy protein, lọc, ly tâm bằng trọng lực, tách từ tính miễn dịch, v.v... có thể được thực hiện. Trong trường hợp thiếu đáp ứng PCR, có thể thực hiện các phương pháp chính xác hơn như đun sôi, sử dụng các chất tạo phức hoặc hóa chất mạnh như cloroform và etanol hoặc dùng các bộ kit thử có tác dụng tương tự. Có thể sử dụng các phương pháp vật lý đơn giản để làm giảm hàm lượng chất béo của các mẫu có hàm lượng chất béo cao. Có thể sử dụng các chất tạo phức để làm giảm hàm lượng canxi cao trong các sản phẩm sữa mà có thể gây ức chế.

6.2  Tách chiết axit nucleic

6.2.1  Tách chiết ADN

6.2.1.1  Giải phóng ADN và tinh sạch

Một số nguyên tắc tách chiết ADN có thể được kết hợp. Ví dụ, có thể thực hiện các bước sau đây:

a) phân hủy các protein trong dịch chiết tế bào bằng các protease (ví dụ proteinase K) và ARN bằng các ribonuclease;

b) kết tủa các peptid tạo thành bằng các dung môi hữu cơ (ví dụ: hỗn hợp của phenol và cloroform) để lại ADN trong pha nước;

c) tinh sạch dung dịch ADN và làm đặc tiếp bằng cách kết tủa trong etanol với sự có mặt của các cation hóa trị một;

d) thu lấy ADN kết tủa bằng cách ly tâm;

e) rửa ADN bằng etanol và hòa lại trong dung dịch đệm [ví dụ: dung dịch đệm tris(hydroxymetyl) aminometan/EDTA (dung dịch đệm Tris-EDTA) hoặc dung dịch đệm Tris].

Đồng kết tủa ADN là glycogen, polyetylen glycol (PEG) hoặc ARN vận chuyển (t-ARN) có thể được sử dụng để cải thiện sự thu nhận ADN trong các bước kết tủa. Chỉ sử dụng các đồng kết tủa không có bất kỳ hoạt tính nuclease, không có chất ức chế/cạnh tranh PCR và không có bất kỳ tương đồng trình tự với các đích PCR tiềm năng được nghiên cứu.

CHÚ THÍCH: Sử dụng các máy sấy đóng băng chân không để làm khô các viên ADN thu được sau bước kết tủa có thể gây nhiễm chéo.

ADN có thể được giải phóng khi phá vỡ tế bào nhiệt (ví dụ bằng cách đun sôi trong 10 min). Sau khi đun sôi, ly tâm mẫu được làm lạnh và sử dụng phần nồi phía trên để chạy PCR. Trước khi đun sôi, để tạo thuận tiện cho việc phá vỡ tế bào, có thể xử lý bằng enzym (ví dụ: sử dụng lysozym, mutanolysin cho các vi khuẩn Gram dương) sau đó ủ protease/proteinase. Có thể cần đến các phương pháp khác như khuấy trộn mạnh các hạt khi sinh vật có thành tế bào khó phá vỡ (ví dụ: Mycobacterium spp.).

Có thể sử dụng phương pháp bất kỳ khác kể cả dùng bộ kit thử thương mại để tách chiết axit nucleic nếu cho các kết quả tương đương.

6.2.1.2  Số lượng và chất lượng ADN

Số lượng và chất lượng của ADN tách chiết được sử dụng phương pháp đã cho trên một nền mẫu nhất định cần cho độ lặp lại và độ tái lập tốt trong quá trình khuếch đại bằng PCR, cung cấp đủ ADN có mặt trong nền mẫu. Đặc biệt, phương pháp được sử dụng phải cho độ thu hồi các đoạn ADN có kích thước trung bình tương đương hoặc lớn hơn so với các sản phẩm PCR được nghiên cứu.

Nồng độ và độ tinh khiết của ADN phân lập được có thể được ước tính bằng các phương pháp huỳnh quang hoặc điện di gel. ADN đã tinh sạch có thể được định lượng bằng các phương pháp quang phổ.

Cách đánh giá nhanh chất lượng và số lượng ADN là điện di trên gel agarose, sau đó nhuộm etidi bromua và đo huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím (UV) (xem Tài liệu tham khảo [1]).

Đối với một số phương pháp chuẩn bị mẫu (ví dụ đun sôi), cần sử dụng trực tiếp dung dịch axit nucleic sau khi chuẩn bị khi các axit nucleic được giải phóng không ổn định.

Nhìn chung, cần tránh lặp lại việc làm đông và rã đông dung dịch axit nucleic.

Sử dụng dụng cụ bằng chất dẻo thích hợp để bảo quản axit nucleic có các lượng bản sao thấp.

CHÚ THÍCH: Một số vật liệu làm ống nghiệm có thể liên kết các axit nucleic.

6.3  Kiểm chứng phản ứng

Thực hiện các phép kiểm chứng phản ứng theo 9.3 và Bảng 1 của TCVN 11134:2015 (ISO 22174:2005).

Phụ lục A

(tham khảo)

Các tiêu chuẩn liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật (vi khuẩn)

Các tiêu chuẩn được liệt kê trong Bảng A.1 bao gồm thông tin liên quan đến việc tăng sinh các vi sinh vật (vi khuẩn).

Bảng A.1 - Các tiêu chuẩn cụ thể đối với các vi sinh vật (vi khuẩn)

Phụ lục B

(tham khảo)

Phương pháp tách chiết ADN từ vi khuẩn Gram âm

B.1  Khả năng áp dụng

Phương pháp này thích hợp để tách chiết ADN từ vi khuẩn Gram âm bằng phân giải hoặc đun sôi.

B.2  Tình trạng

Phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi^[1]. Ngoài ra, phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong một nghiên cứu cộng tác để phát hiện các chủng Salmonella trong các mẫu canh thang tăng sinh từ sữa bột ^{[2], [3]} và trong một nghiên cứu cộng tác để phát hiện Escherichia coli sinh verotoxin (VTEC) trong thịt xay ^{[4], [5]}.

B.3  Nguyên tắc

Phương pháp này bao gồm các bước ly tâm để thu lấy vi khuẩn. Các tế bào vi khuẩn được rửa, phân giải và ủ ở 95 °C đến 100 °C và sau đó được ly tâm để kết tủa các mảnh vỡ thành tế bào, các polysaccharid và protein để thu được chất chiết axit nucleic.

Nguyên liệu khởi đầu thường là canh thang đã được tăng sinh.

B.4  Thuốc thử

B.4.1  Dung dịch đệm rửa, nước muối sinh lý [ρ(NaCl) = 9 g/l] hoặc nước muối đệm phosphat (PBS) ρ(NaCl) = 8 g/l, ρ(KCl) = 0,2 g/l, ρ(Na₂HPO₄) = 1,44 g/l, ρ(KH₂HPO₄) = 0,24 g/l; pH 7,4].

B.5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

B.5.1  Microlit pipet.

B.5.2  Máy ly tâm Bench-top, dùng cho các bình phản ứng microlit, có dung tích từ 1,5 ml đến 2 ml và có thể chỉnh gia tốc ly tâm đến 10 000 g.

B.5.3  Nồi cách thủy hoặc khối nhiệt, dùng cho bình phản ứng microlit, có khả năng làm nóng đến 100 °C.

B.5.4  Máy khuấy trộn, ví dụ: máy trộn vortex.

B.6  Cách tiến hành

B.6.1  Yêu cầu chung

Sau khi tăng sinh, ADN của vi khuẩn được tách chiết theo B.6.2,

B.6.2  Quy trình tách chiết

Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào ống phản ứng. Ly tâm huyền phù tế bào trong 10 min ở gia tốc 10 000 g (B.5.2). Gạn phần nổi phía trên.

Hòa lại phần cặn trong 1 ml dung dịch đệm rửa (B.4.1) hoặc nước. Ly tâm huyền phù tế bào trong 10 min ở gia tốc 10 000 g (B.5.2). Gạn phần nổi phía trên.

Hòa lại phần cặn trong khoảng từ 200 µl đến 250 µl nước. Thực hiện việc phân hủy tế bào nhiệt bằng cách gia nhiệt trong 20 min ở 95 °C (Salmonella) hoặc 15 min ở 100 °C (STEC).

Chuyển các bình phản ứng sang bể đá lạnh để làm nguội nhanh.

Trộn mạnh dịch phân giải [ví dụ: sử dụng máy khuấy trộn (B.5.4)]. Ly tâm ở nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C trong 3 min ở gia tốc 10 000 g (Salmonella) hoặc 10 s ở gia tốc 10 000 g (STEC).

Chuyển phần nổi phía trên sang bình phản ứng microlit mới.

Các chất chiết axit nucleic gây ức chế PCR, được chỉ rõ qua các phép kiểm soát thích hợp, phải được tinh sạch trước khi sử dụng trong PCR.

Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có thể sử dụng các hệ thống tách chiết và tinh sạch có sẵn trên thị trường thay cho việc phân giải tế bào nhiệt và tinh sạch cần thiết.

B.7  Đánh giá xác nhận

Phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi và là phương pháp cơ bản trong sinh học phân tử. Ngoài ra, phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong các thử nghiệm cộng tác.

Năm 1998, một thử nghiệm liên phòng được DIN (Viện Tiêu chuẩn Đức) tổ chức nhóm làm việc "PCR để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm". Mười hai phòng thí nghiệm đã tham gia vào thử nghiệm này, mỗi phòng thử nghiệm nhận được 20 mẫu. Mẫu là sữa bột ít chất béo. Một phần của sữa bột này đã được gây nhiễm nhân tạo với mức 1 000 cfu Salmonella/25 g. Trong các phòng thí nghiệm các mẫu đã được chuẩn bị như sau đây trước khi tách chiết ADN: 25 g mẫu được cho vào 250 ml chất lỏng tăng sinh không chọn lọc (xanh brilliant 0,002 %) và ủ ở 37 °C trong 16 h. Việc tách chiết axit nucleic bắt đầu với 1 ml canh thang mẫu đã tăng sinh này. Các dịch chiết đã được thử nghiệm bằng PCR. Tổng số có 240 mẫu được phân tích; 1 mẫu đã được tìm thấy là âm tính giả và 2 mẫu dương tính giả; 14 mẫu ức chế PCR đã được quan sát.

Năm 2001, phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong một nghiên cứu cộng tác của nhóm làm việc "PCR để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm" của Viện nghiên cứu Liên Bang Đức bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và thuốc thú y (BgVV) theo Điều 35 của Luật thực phẩm - Liên bang Đức. Mười một phòng thử nghiệm đã tham gia. Mỗi phòng nhận được mười mẫu thịt xay được chuẩn bị từ hai nền mẫu cơ bản. Trong mỗi trường hợp, năm trong số các mẫu bị nhiễm đồng đều về các chủng STEC/EHEC với các mức nhiễm 54 cfu/25 g và 308 cfu/25 g thịt xay. Hệ sinh vật kèm theo với mức nhiễm từ 10⁵ cfu/g đến 10⁶ cfu/g và đôi khi cao hơn (do kết quả của việc vận chuyển). Các mẫu từ 1 đến 9 (được chuẩn bị từ vật liệu cơ bản) là các mẫu bị nhiễm tự nhiên với 4 chủng STEC. Tỷ lệ phát hiện PCR đối với tất cả các phòng thử nghiệm là 100 %.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1987 (ISBN 0-87969-309-6)

[2] SCHEU, P., GASCH, A., ZSCHALER, R., BERGHOF, K. and WILBORN, F. Evaluation of a PCR-ELISA for food testing: Detection of selected Salmonella serovars in confectionery products. Food Biotechnology, 12 (1&2), 1998, pp. 1-12

[3] DIN 10135:1999, Method for detection of Salmonella using PCR polymerase chain reaction

[4] G ALLIEN, P., RICHTER, H., MUCH, Chr., FRÖBE, I., PERLBERG, K.-W. and PROTZ, D. Optimierung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis und zur Charakterisierung von Shigatoxin-produzierenden Escherichia coli (STEC). Lebensmitteln. Beri. Münch. Tierärztl. Wschr. 110, 1997, p. 422

[5] Detection, isolation and characterization of verotoxin-forming Escherichia coli (VTEC) in minced meat by means of PCR and DNA hybridization. No. L 07.18-1 in: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal health Office, loose leaf edition, Beuth Verlag GmbH

[6] TCVN 4829 (ISO 6579), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch.

[7] TCVN 4830-3 (ISO 6888-3), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch - Phần 3: Phát hiện và dùng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) để đếm số lượng nhỏ.

[8] TCVN 4992 (ISO 7932), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Bacillus cereus giả định trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C.

[9] TCVN 4991 (ISO 7937), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng Clostridium perfringens trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

[10] TCVN 7715-1 (ISO 10272-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Campylobacter spp. - Phần 1: Phương pháp phát hiện.

[11] TCVN 8127 (ISO 10273), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phát hiện Yersinia enterocolitica gây bệnh giả định.

[12] TCVN 7700-1 (ISO 11290-1, With Amd. 1:2004), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng Listeria monocytogenes - Phần 1: Phương pháp phát hiện.

[13] TCVN 7686 (ISO 16654), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Escherichia coli 0157.

[14] TCVN 11131 (ISO/TS 20836), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát hiện vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Phép thử hiệu năng đối với máy chu trình nhiệt.

[15] TCVN 7682 (ISO 20838), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) để phát hiện sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu về khuếch đại và phát hiện đối với các phương pháp định tính.

[16] TCVN 8131 (ISO 21567) Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Shigella spp.